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羰基还原酶具有反应条件温和、高效、高度的立体选择性、绿色环保等强大优点,已成为生物催化制备手性芳香醇的主要生物催化剂。本研究基于选择性区域氨基酸突变技术,通过改造(S)-羰基还原酶SCRII的生物催化功能,克服了天然酶的先天不足,理性拓宽了该酶催化苯乙酮衍生物的底物选择性。另外,通过将葡萄糖脱氢酶GDH引入到反应中,构建辅酶循环体系,获得了高催化效率的共表达重组菌株,对其全细胞和游离酶体系催化苯乙酮进行了进一步研究。具体内容包括:(1)通过氨基酸序列和蛋白结构比对的方法,选择SCRII底物结合域中关键氨基酸位点E228实施突变,构建相应的突变株Escherichia coli BL21/pET-E228S。酶活测定结果表明突变株E. coli BL21/pET-E228S催化苯乙酮、4’-甲基苯乙酮、4’-氯苯乙酮、4’-溴苯乙酮的酶活是突变前的7~20倍。研究还发现:突变株拓宽了催化苯乙酮衍生物的底物选择性,以苯乙酮、4’-甲基苯乙酮、4’-氯苯乙酮、4’-溴苯乙酮为底物时,生物转化产物光学纯度(e.e.值)维持在>99%,得率高达80%以上。(2)基于芽孢杆菌属葡萄糖脱氢酶氨基酸序列的保守性,钓取来源于Bacillus sp. YX-1的葡萄糖脱氢酶基因gdh,构建诱导型表达载体pET-gdh,经镍柱亲和层析纯化重组蛋白。酶学性质的研究结果表明:该重组葡萄糖脱氢酶具有良好的有机溶剂耐受性,于50%的辛烷、环己烷、癸烷中室温放置1 h后,酶活仍保持在90%以上;具有较宽广的底物谱,可催化多种糖用于辅酶再生;具有相似的双辅酶NAD(P)+依赖型,对NAD+和NADP+的比活分别为8.37 U/mg和8.62 U/mg;最适反应温度和pH值分别为45℃和8.0。(3)利用重叠延伸PCR的手段构建了E228S与GDH的共表达及融合表达菌株,分析了其生物催化功能。以苯乙酮为模式底物,筛选获得了一株共表达菌株BL21/pET-S-SD-AS-G,不对称还原苯乙酮的底物浓度高达10 g/L,产物(R)-苯乙醇的得率和e.e.值分别高达92%和>99%,反应时间为12 h。(4)最后,本研究采用重组表达的游离酶体系代替重组菌细胞进一步提高转化苯乙酮的浓度和效率。当底物浓度为10 g/L时,辅酶NADP+的添加量为0.03 mmol/L,产物(R)-苯乙醇的得率和e.e.值分别高达89%和>99%,反应时间缩短至1 h。选择底物分批补料策略将苯乙酮的浓度提高至20 g/L,产物的得率和e.e.值分别为86%和>99%。