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近年来,食品安全已经成为全世界共同关注的问题,由生物毒素引发的食物中毒事件层出不穷,不仅对人类健康造成危害还对社会造成了巨大经济损失。生物毒素是一类由生物自身分泌代谢产生的有毒物质。按照其来源不同,可以将其分为动物毒素、植物毒素、海洋毒素以及微生物毒素四大类,其中我国以微生物毒素最为常见;按照化学结构不同,可将生物毒素分为大分子毒素和小分子化合物毒素两大类,前者又可细分为蛋白类毒素、多糖类毒素和多肽类毒素。生物毒素通过高特异性选择作用于细胞膜、受体、离子通道等特定靶位分子形成不同程度的毒害或致死效应。生物毒素具有结构复杂、毒性强、分布广泛且不易解毒等特点,其中由于蛋白类毒素易失活,构建相应检测方法难度较大,导致现有检测方法还不健全,因此建立快速高效的检测方法用于蛋白类毒素的检测至关重要。本研究通过选取在临床中毒中较为常见的蛋白类毒素,例如副溶血弧菌分泌的耐热直接溶血素（Thermostable direct hemolysin,TDH）、肉毒梭菌分泌的A型肉毒毒素（Botulinum neurotoxin serotype A,Bo NT/A）与B型肉毒毒素（Botulinum neurotoxin serotype B,Bo NT/B）,以及植物毒素中最具代表性的蓖麻毒素（Ricin toxin,RT）作为研究对象,利用镧系元素Stokes位移大,荧光寿命长,发射光谱带窄等特点,建立了基于镧系荧光微球的免疫层析试纸条用于TDH、Bo NT/A和Bo NT/B的检测;除此之外,还建立了基于镧系穴状化合物的均相时间分辨荧光免疫分析技术用于RT的检测。主要内容如下:一、分别建立了用于TDH检测的镧系免疫层析检测试纸与ELISA方法。首先通过分子克隆技术制备了高纯度的TDH重组蛋白,并利用该重组蛋白通过免疫新西兰白兔获得了高亲和力的多克隆抗体。经测试发现,本实验制备的多克隆抗体亲和力可达1×10-8M-1,使用该高亲和力抗体同时建立了镧系免疫层析试纸条检测方法与ELISA方法,前者灵敏度为50ng/m L,其定量范围为50～5000ng/m L;后者灵敏度为78ng/m L,定量范围为78～312ng/m L。两种检测方法的特异性和重复性良好,在检测海鲜样本时灵敏度均未发生改变,且具备检测天然毒素的能力。结果显示两种方法均优于目前国内已报道的用于TDH检测的免疫学方法。二、制备了用于A型与B型肉毒毒素检测的镧系免疫层析检测试纸。首先使用凝胶柱和离子交换柱对A型与B型肉毒毒素进行精纯,获得了高纯度的天然毒素,二者纯度分别为88.11%和91.98%,利用该毒素对本室前期制备的抗体进行筛选,获得了一株高亲和力的多克隆抗体用于后期方法建立。利用该抗体制备了用于A型肉毒毒素检测的镧系免疫层析检测试纸,获得了良好的灵敏度,可达1ng/m L。为了提高检测方法的特异性以及实现分型,使用本室研制的纳米抗体制备了用于A型与B型肉毒毒素检测的镧系免疫层析检测试纸,灵敏度分均为5ng/m L。并将制备得到的免疫层析试纸条对52例临床样本进行检测,临床符合率为84.60%,其中纳米抗体的临床符合率为79.50%,多抗为100%。基于纳米抗体制备的检测试纸可以进行分型,具有较好的特异性,而基于多抗的检测试纸临床样本符合率高,两种方法各有优势,联合使用可以提高检测结果的准确性。本方法操作简便、耗时短,给临床工作提供了很好的辅助诊断工具,极适合在基层医院推广使用。三、设计并建立了用于RT检测的均相时间分辨荧光免疫分析方法。通过将均相免疫分析技术与时间分辨荧光能量共振转移相结合,以镧系穴状化合物作为能量供体,别藻蓝蛋白作为能量受体,成功构建了一种基于镧系穴状化合物的均相免疫分析方法用于RT的检测,该方法的灵敏度为1ng/m L,而且其线性范围较宽可达1～10000ng/m L。本实验室早期已建立了用于RT检测的镧系免疫层析方法与ELISA方法,本方法与之相比,灵敏度更高,线性范围明显增宽,与免疫层析或ELISA所需的80～100μL样品体积相比,本方法的上样量仅为10μL,为原来的1/8～1/10,整个检测体系仅为30μL,且无需清洗,为后续高通量现场检测新方法的建立提供了新思路。综上,本研究利用镧系荧光完成了食源性蛋白毒素检测方法的建立。首先,建立了基于镧系荧光微球的免疫层析试纸用于TDH,Bo NT/A和Bo NT/B的检测,此类方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、耗时短、无需专业的检测人员和大型的检测仪器等优点,具有很高的应用价值,为早期临床诊断以及食品安全检测等领域提供方法。除此之外,基于镧系穴状化合物建立了用于RT检测的均相时间分辨荧光免疫分析方法,该方法无需清洗,操作简单,线性范围较宽,反应过程和检测过程可实现一体化,在高通量现场检测领域具有十分广阔的应用前景。