目的食管癌是全球癌症引发的相关死亡的主要原因之一。在全世界范围内,大约一半的食管癌病例均发生在中国。随着科技的进步,食管癌的诊疗过程在早期发现、精确诊断和联合治疗方面取得了巨大的进步,但食管癌的整体五年生存率仍然较低。肿瘤是一个逐渐发生的慢性过程,肿瘤细胞与周围细胞的相互作用形成复杂多变的肿瘤微环境,并决定着肿瘤的进展和结局。肿瘤微环境中免疫效应细胞的功能状态,是影响肿瘤转归的关键机制之一。免疫细胞是人体发挥免疫监视功能的重要细胞,免疫细胞的功能缺陷是肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制之一。T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(Tim-3)作为一个新的免疫检查点,在免疫细胞的表面表达会导致免疫细胞识别、杀伤肿瘤细胞的能力下降,功能趋向于耗竭。然而Tim-3分子在食管癌患者肿瘤微环境中的作用尚不明确。自然杀伤(natural killer,NK)细胞是人体固有免疫系统的重要效应细胞,参与机体抵御外来侵害及肿瘤的第一道防线。在肿瘤患者中,NK细胞可以直接杀伤肿瘤细胞和分泌IFN-γ等细胞因子,因此靶向恢复NK细胞的功能可能是肿瘤治疗的新策略。本课题主要研究食管癌肿瘤微环境中NK细胞功能缺陷的原因、特征及其临床意义。期望找到恢复NK细胞功能的方法进而改善患者的预后,最终为食管癌患者免疫治疗提供潜在的靶点。方法我们收集了53例食管癌患者组织标本及外周血,利用流式细胞术检测食管癌患者外周和肿瘤浸润的NK细胞的Tim-3,Annexin V,CD69,CD107a和IFN-γ的表达;运用冰冻组织切片做免疫荧光检测食管癌肿瘤组织及癌旁组织中Tim-3与NK的表达及相关性;使用流式细胞仪分选出食管癌肿瘤微环境中Tim-3~+和Tim-3~-两群NK细胞,微量扩增的方式提RNA、反转录,最后运用实时荧光定量PCR检测分选出的这两群细胞中干扰素-γ,颗粒酶B,穿孔素和NKG2D的相对mRNA表达量;利用磁珠分选出纯化的NK细胞,利用TNF-α重组蛋白培养诱导NK细胞表达Tim-3;采用细胞免疫荧光、实时荧光定量PCR和流式细胞术检测TNF-α重组蛋白培养诱导NK细胞后,NK细胞表面Tim-3的表达情况;在人和小鼠的标本中测量肿瘤组织中的Tim-3和TNF-αmRNA水平;下载TCGA数据库,分析Tim-3和TNF-αmRNA表达水平及两者的相关性;最后分析了Tim-3~+NK细胞的比例与临床病理参数的相关性。结果我们发现与健康人外周血相比,食管癌患者外周血及肿瘤微环境中NK细胞比例明显下降。其次,Tim-3~+的NK细胞主要在肿瘤组织部位有明显的聚集,并且Tim-3~+NK细胞的功能呈现出耗竭状态。体外给予TNF-α重组蛋白可以通过ΝF-κB诱导ΝΚ细胞Τim-3的表达。小鼠和人的肿瘤组织中TNF-α和Tim-3的表达成明显正相关。最后我们发现NK细胞表面Tim-3的表达与食管癌患者肿瘤浸润程度、淋巴结转移和临床病理分期密切相关。结论Tim-3在食管癌患者NK细胞表面的表达增高导致了NK细胞功能耗竭,提示Tim-3可能成为一个潜在恢复NK细胞功能的食管癌免疫治疗靶点。