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目的:皮肤是人体的第一道屏障,它发挥保护机体免受外界因素损害的重要作用。皮肤纤维化是大众都会经历的过程,在正常情况下是皮肤创口愈合的有益组织反应,但是过度纤维化破坏皮肤美观,影响皮肤功能,甚至造成劳动能力丧失,因器官功能障碍和心理效应极大降低人们的生活质量。皮肤纤维化的机制尚不完全清楚。皮肤纤维化是组织损伤异常修复的结果,往往伴随慢性或严重真皮层损伤和炎症反应。核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2）是一种核转录调节因子,其介导的抗氧化反应体系是正常细胞抵抗外源性和内源性的氧化应激的重要屏障。皮肤损伤愈合伴随着皮肤纤维化的发生,这一过程中产生的活性氧既可以防御细菌入侵,也可诱导损伤进一步加剧,Nrf2在此过程具有重要意义,但具体作用有待进一步解析。以往研究发现,Nrf2全身缺失小鼠涉及早期伤口愈合的各种关键参与者的表达显着降低,修复的晚期阶段则表现为炎症延长,促进纤维化的发生。有研究发现,成纤维细胞中Nrf2缺失时,Nrf2的激动剂CDDO在成纤维细胞中发挥抵御皮肤纤维化发生的作用。皮肤外用药直接作用于表皮层,但角质形成细胞中Nrf2在皮肤纤维化中的作用未见报道。因此,本研究以小鼠为研究模型对角质形成细胞中的Nrf2在皮肤纤维化中的作用进行探索,为皮肤纤维化防治和Nrf2调节剂的应用提供新思路。研究方法:1.运用Cre-loxP系统建立Nrf2（K）-KO小鼠模型:本实验小鼠以C57BL/6小鼠为背景,K14-Cre小鼠与Nrf2-KI小鼠杂交。Cre作为位点特异性重组酶,识别loxP位点,K14作为角质形成细胞中特异性启动子驱动的Cre重组酶,K14-Cre通过剪切loxP位点包围的DNA序列,构建特异性敲除小鼠。并利用PCR技术扩增DNA,利用琼脂糖凝胶成像系统获得小鼠DNA条带,鉴定所得仔鼠的基因型。2.Nrf2（K）-KO小鼠模型鉴定:1.2 U/mL浓度dispase II分离皮肤表皮层与真皮层,通过实时荧光定量聚合酶链反应（Reverse Transcript Quantitative PCR,RT-qPCR）检测Nrf2（K）-KO小鼠与Nrf2-KI小鼠皮肤表皮层中Nrf2、Nrf1、Nrf3的mRNA表达水平,及其他对照器官肝、肾和膀胱中Nrf2的mRNA表达水平;通过Western Blot法检测两者NRF2蛋白水平的表达。3.博来霉素（Bleomycin,BLM）诱导的小鼠皮肤纤维化模型建立:实验组小鼠给予背部皮肤皮下注射BLM三周（0.5 mg/mL,100μL/次,隔日注射）,即BLM实验组;对对照组小鼠给予皮下注射PBS三周（100μL/次,隔日注射）,即PBS对照组。野生型小鼠给予背部皮肤皮下注射BLM/PBS,通过HE染色,从形态学分析皮肤纤维化是否成功,并通过Western Blot法检测两者NRF2蛋白水平的表达。4.角质形成细胞中Nrf2在小鼠皮肤纤维化中的作用:将6周龄雄性小鼠分为四组,即Nrf2-KI对照组、Nrf2-KI实验组、Nrf2（K）-KO对照组和Nrf2（K）-KO实验组。对小鼠背部皮肤给予HE染色分析角质形成细胞中Nrf2的作用,并通过Image J测量真皮层厚度。免疫荧光法测定纤维化指标胶原蛋白III（Collagen III,COL III）在小鼠真皮层中蛋白表达水平。免疫组化法检测另一纤维化指标α-SMA在小鼠真皮层中蛋白表达水平。分别通过Image J测定小鼠皮肤中阳性细胞数量。5.角质形成细胞中Nrf2的缺失对炎症的影响:实验组小鼠给予背部皮肤皮下注射BLM（0.5 mg/mL,100μL/次,注射一次）,对照组小鼠给予皮下注射PBS（100μL/次,注射一次）,分组同皮肤纤维化模型,在注射后6 h获取小鼠皮肤组织。通过HE染色,观察小鼠皮肤炎性浸润情况,通过免疫组化法检测LY6G及F4/80的表达,二者分别为中性粒细胞和巨噬细胞标志物,以此判定浸润的细胞类型。并通过Image J分别对炎性细胞浸润数量,中性粒细胞数量及巨噬细胞数量进行测定。6.BLM对HaCaT细胞中趋化因子表达的影响:对HaCaT的野生型细胞分别用1μM及10μM BLM处理6 h,通过RT-qPCR法检测mRNA水平上趋化因子（IL-8、MCP-1、CCL-3、CCL-4、CCL-5、CXCL-10）、炎症因子（IL-6和IL-1β）、细胞因子（TNF-α和TGF-β1）的表达。7.NRF2基因沉默与验证:用携带靶向NRF2 shRNA的慢病毒（NRF2knockdown,NRF2-KD）与非靶标阴性对照慢病毒（Scramble,Scr）转染HaCaT细胞,用1μg/mL嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞。用10μM亚砷酸钠（NaAsO2,As）分别处理Scr细胞和NRF2-KD细胞6 h,并通过Western Blot法检测NRF2蛋白水平的表达。8.HaCaT细胞中NRF2的缺失对趋化因子及细胞因子表达的影响:分别对Scr细胞和NRF2-KD细胞用1μM及10μM BLM处理6 h,通过RT-qPCR发检测趋化因子及细胞因子（包括IL-6、IL-8、MCP-1、CCL-3、CCL-5、CXCL-10）的表达水平。结果:1.Nrf2（K）-KO小鼠模型鉴定成功:琼脂糖凝胶成像结果显示,174 bp条带代表携带loxP位点,同时,当324 bp和494 bp两条带同时存在代表携带K14-Cre,即Nrf2（K）-KO小鼠,324 bp条带单独存在代表不携带K14-Cre,即Nrf2-KI小鼠。在mRNA水平和蛋白水平,与Nrf2-KI小鼠相比,Nrf2（K）-KO小鼠角质形成细胞中Nrf2的表达均显著下降,分别为Nrf2-KI小鼠的6%和10%,结果有统计学差异（P<0.05）;角质形成细胞中其他Nrfs家族成员Nrf1和Nrf3表达无显著改变;肝脏、肾脏和膀胱三个对照组织Nrf2表达水平在Nrf2（K）-KO和Nrf2-KI小鼠间差异无统计学意义。2.BLM诱导的小鼠皮肤纤维化模型建立:与对照组相比,实验组小鼠出现纤维化,表现为真皮层增厚且纤维束排列紊乱,皮肤皮内脂肪层被消磨,角质层出现增厚且紧密,且表皮层中NRF2的蛋白质水平显著降低（P<0.05）。3.角质形成细胞中Nrf2在小鼠皮肤纤维化过程中起保护作用:与对照组小鼠相比,实验组Nrf2-KI小鼠、K14-Cre小鼠和Nrf2（K）-KO小鼠均出现皮肤纤维化,表现为真皮层增厚（P<0.05）,真皮层中皮肤纤维化标志α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的阳性细胞增多（P<0.05）,真皮层中纤维化标COL III的阳性荧光增多（P<0.05）。对照组Nrf2（K）-KO与Nrf2-KI小鼠和K14-Cre小鼠的皮肤间差异无统计学意义。实验组Nrf2（K）-KO小鼠与Nrf2-KI小鼠和K14-Cre小鼠相比,真皮层增厚（P<0.05）,α-SMA阳性细胞显著增加（P<0.05）,COL III荧光增强（P<0.05）。4.角质形成细胞中Nrf2的缺失促进炎症反应:HE染色显示,与对照组相比,实验组出现明显的炎性浸润,炎症细胞增加（400×,P<0.05）;实验组中,与Nrf2-KI小鼠相比,Nrf2（K）-KO小鼠炎性浸润更为严重。免疫组化染色显示,与对照组相比,实验组表现为中性粒细胞和巨噬细胞标志物阳性（P<0.05）;且实验组中,与Nrf2-KI小鼠相比,Nrf2（K）-KO小鼠皮肤中中性粒细胞和巨噬细胞数量显著增多（P<0.05）。5.BLM促进HaCaT细胞中细胞因子和趋化因子的表达:HaCaT细胞经1μM及10μM BLM处理6小时后,细胞内TNF-α、CCL-3、CCL-4、IL-6、IL-8和MCP-1的mRNA表达均有升高,其中IL-6、IL-8和MCP-1的升高存在剂量反应关系（P<0.05）。6.HaCaT细胞中NRF2沉默促进趋化因子及细胞因子的表达:HaCaT细胞中NRF2被成功沉默。RT-qPCR结果显示NRF2-KD细胞中IL-6、IL-8、MCP-1的表达均高于Scr细胞（P<0.05）,尽管CCL-3、CCL-5、CXCL-10的表达也显著增高,但是基础表达量过低。结论:1.成功建立Nrf2（K）-KO小鼠的模型。Nrf2（K）-KO小鼠对博来霉素诱导的皮肤纤维化更为敏感。2.Nrf2的缺失导致角质形成细胞中细胞因子和趋化因子表达增多,可能加剧皮肤炎症反应,进而促进博来霉素所致皮肤纤维化的发生。