竹红菌甲素的发酵调节与抗菌特性研究

来源 :闫晓晓 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cangyueshang
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竹红菌色素(Hypocrellins,HYPs)是从药用真菌竹红[Hypocrella bambusae(Berk.&Broome)Sacc.]或者竹黄(Shiraia bambusicola Henn.)的子座中分离得到的一类疏水性苝醌类化合物。其主要包括四种衍生物:竹红菌甲素(Hypocrellin A,HA),竹红菌乙素(Hypocrellin B,HB),竹红菌丙素(Hypocrellin C,HC)和竹红菌丁素(Hypocrellin D,HD)。HYPs因具有抗癌、抗病毒和抗菌活性而在近四十年来备受关注。HYPs具有突出的光诱导活性,其原理为通过光催化生成单线态氧和活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),非靶向作用于细胞壁、细胞膜、蛋白质、脂质和核酸,从而导致细胞死亡,可用于光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)。相较于传统抗菌药物的广泛重复使用导致许多微生物的耐药性提高,传统的抗菌药物已经难以抵抗微生物感染,而PDT这种非靶向机制能够减少微生物产生耐药性的机会。尽管HYPs具有良好的光疗活性,但目前在应用上还存在着一些亟待解决的问题:HYPs是一种亲脂性化合物,水溶性差,不便于制成药物制剂;并且HYPs来源有限,目前微生物发酵技术是用于大规模生产HYPs一条可行的方法。本研究基于前期筛选的深层发酵菌株S.bambusicola GDMCC 60438,通过探索改变培养条件、处理种子液和添加外源化合物的技术来提高HYPs产量,为HYPs的应用和工业化生产提供理论基础和科学依据。同时,为了更加全面地了解HYPs对各类病原微生物的抗菌活性,本文系统研究了HA(产量相对较高的一种HYPs)对黑曲霉(Aspergillus niger CMCC(F)98003)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus AA-01)、白色念珠菌(Candida albicans CMCC(F)98001)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC(B)26003)和大肠杆菌(Escherichia coli CMCC(B)44102)的抑制或杀死效力。为充分提升HYPs的抗菌效率,探讨了光照条件(波长、光强、时长等)、HA浓度、p H等因素对HA抗菌活性的影响规律。通过形态观察和转录组分析等手段进一步分析HA抑菌活性的分子机制。本研究得到了如下结果:深层发酵HYPs生产菌株S.bambusicola GDMCC 60438在p H=6.4的发酵起始条件和32℃发酵条件下合成HYPs具有最高的产率,以HA的产量为标准(HYPs产品的主要成分为HA,其含量≥95%),得到HA的产量为154.54 mg/L。在发酵开始第12 h添加1 mg/L的VB1,HA产量相比于对照组可以提升32.41%;通过在发酵开始第12 h添加200 m M的KCl,HA产量相较对照组提高了68.61%,达到了243.06 mg/L。HA样品在465-470 nm波长的光照下具有相对更强的抗真菌作用。1-10 ppm的HA能够抑制A.niger CMCC(F)98003和A.aculeatus AA-01的生长。这种抑制作用对光照强度和光照时长具有显著相关性。有氧条件下,HA对曲霉属真菌的光动力抑制活性与催化产生的ROS水平有关。扫描电镜和转录组揭示了A.niger原生质体的壁/膜结构被破坏,这可能是HA光动力抑制霉菌菌丝的生长的重要原因之一。低浓度的HA(<2.5 ppm)具有抑制C.albicans CMCC(F)98001生长、抑制生物膜形成和清除生物膜的活性。H2O2(<50 m M)与HA联合使用能够显著提升抗念珠菌的活性。其作用的机理在于提高C.albicans的细胞膜通透性并提高胞内的ROS水平,在影响C.albicans细胞数量增加的同时也能够抑制菌丝的形成,从而减轻C.albicans的感染力和毒力。HA对S.aureus CMCC(B)26003具有显著的杀灭效力,在465-470 nm波长、p H=7.5溶液环境下,2.5 ppm的HA能够完全杀死S.aureus。HA对细菌的杀灭作用依赖浓度和光强度。长时间(>15 min)低强度的光照更利于其发挥杀菌作用。本研究通过调节S.bambusicola液态发酵过程提升了HA产量,选择A.niger、A.aculeatus、C.albicans、S.aureus和E.coli作为HA的作用对象,探究了HA使用的适宜浓度、光照强度、光波长、照射时长等条件,对于推动HA生产应用、解决微生物耐药性问题具有一定的意义。
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