背景与目的食管癌为世界八大常见肿瘤之一,其中鳞癌和腺癌是两种常见的病理类型。食管鳞癌盛行于东南亚地区,具有高致死率的特点。在中国东部地区,食管鳞癌的发病率居全部恶性肿瘤第4位。目前食管鳞癌发生发展的机制仍不明确,因此针对中晚期不可手术的食管鳞癌,由于肿瘤向外围组织侵犯并远处播散形成转移灶,在治疗方面也仅仅只是依靠全身综合性化疗加上局部的放射治疗,效果十分有限。而侵袭和转移是肿瘤发展的本质属性,因此努力寻找和发现食管鳞癌侵袭和转移过程中的关键分子和特殊靶点,并针对性地采取有效的治疗方法,为食管鳞癌靶向精准治疗开辟新的篇章势在必行。microRNA是一类具有重要调节功能的小分子非编码RNA。我们根据前期基因芯片分析发现miR-375在食管鳞癌中呈低表达。过表达miR-375可抑制食管鳞癌细胞增殖、侵袭和转移能力；阻断miR-375表达则可促进食管鳞癌细胞增殖、侵袭和转移能力。本研究旨在探索miR-375及其靶基因形成的功能通路参与调控食管鳞癌侵袭转移的可能机制以及临床意义。材料、方法及结果第一章miR-375在人食管鳞癌中的表达差异及其作用方法：1.收集5例食管鳞癌组织和对应的癌旁正常上皮组织,运用基因芯片技术检测miRNA差异表达谱。2.运用PCR验证食管鳞癌组织及细胞之中的miR-375表达水平。3.构建]miR-375 mimics, inhibitor及NC,转染食管鳞癌细胞后行MTT实验,划痕实验,克隆形成实验及transwell实验分析miR-375对细胞增殖、侵袭和转移的作用。结果：1.基因芯片分析显示食管鳞癌与对应癌旁组织相比,差异表达50倍以上的miRNA有12条。其中,miR-375在食管鳞癌组织之中下调最为显著。2.组织及细胞mRNA水平证实食管鳞癌miR-375表达水平均不同程度低于正常食管上皮。3.过表达miR-375后食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和转移能力减弱；而干扰miR-375表达后细胞的增殖、侵袭和转移能力增强。第二章miR-375靶向负调控SHOX2表达及SHOX2的作用和意义方法：1.生物信息学软件(TargetScan、miRanda、PicTar、miRTarget2和PITA)预测miR-375下游靶基因,并luciferase,PCR和Western Blot验证。2.分别构建SHOX2基因的过表达和干扰质粒,转染入食管鳞癌细胞后行MTT实验,划痕实验,克隆形成实验及transwell实验分析SHOX2对细胞增殖、侵袭和转移的作用。3.选取2007年-2013年间南京军区总医院心胸外科手术后食管鳞癌及配对癌旁组织病理标本100例,免疫组化染色后观察SHOX2表达情况。4.在100例食管鳞癌组织标本中,对比免疫组化染色结果,运用统计学方法分析SHOX2表达与患者预后的关系。结果：1. miRNA靶基因预测软件显示：miR-375在SHOX23’UTR1156-1170 bp间有且仅有1个保守结合位点。而luciferase,聚合酶链反应和蛋白质印迹结果均提示：niRNA-375直接负向调控SHOX2表达。2.过表达SHOX2后可加强食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和转移能力；而阻断SHOX2后则削弱细胞的增殖、侵袭和转移能力。3.与配对癌旁组织相比,食管鳞癌组织内SHOX2基因明显呈高阳性表达。4.单因素分析显示：食管鳞癌组织标本中SHOX2高表达与患者预后不良相关(p=0.019)。SHOX2高表达与肿瘤原发灶情况,淋巴结转移及病理分期相关p=0.006,<0.001和<0.001)。多因素生产分析显示：SHOX2表达与病理分级和临床分期相关p<0.001和=0.033)。第三章m i R-375与SHOX2对食管鳞癌上皮-间质转化作用的研究方法：1.在食管鳞癌细胞中过表达miR-375后,运用PCR、Western Blot、ICC技术检测上皮及间质成分的特定标志物E-cadherin,β-catenin,Vimentin和N-cadherin的表达变化。2.在食管鳞癌细胞中过表达SHOX2基因后,运用PCR、Western Blot、ICC技术检测上皮及间质成分的特定标志物E-cadherin,β-catenin, Vimentin和 N-cadherin的表达变化。3.在食管鳞癌细胞中共转染rniR-375 mimics和过表达SHOX2质粒后行拯救实验,运用PCR、Western Blot、ICC技术检测上皮及间质成分的特定标志物E-cadherin,β-catenin,V imentin和N-cadherin的表达变化。4.运用裸鼠皮下成瘤技术,接种稳定转染过表达SHOX2基因质粒后的食管鳞癌细胞,并通过PCR和Western Blot技术对瘤体组织行E-cadherin,β-catenin, Vimentin和N-cadherin的表达检测。结果：1.过表达miR-375后,食管鳞癌细胞(kyse-70、eca109、EC9706)上皮特定标志物E-cadherin和β-catenin表达增强；而间质特定标志物Vimentin和N-cadherin表达下降。2.过表达SHOX2基因后,食管鳞癌细胞(kyse-70、eca109、EC9706)上皮特定标志物E-cadherin和β-catenin表达减弱；而间质特定标志物Vimentin口N-cadherin表达增强；3.共转染1niR-375 mimics和过表达SHOX2质粒于食管鳞癌细胞后,E-cadherin和β-catenin在外源性miR-375影响下表达上调,而随着外源性SHOX2的加入而表达减弱；Vimentin和N-cadherin在外源性miR-375影响下表达下调,而随着外源性SHOX2的加入而表达增强。提示miR-375通过抑伟SHOX2表达,负向调控食管鳞癌细胞的EMT进程。4.接种过表达SHOX2质粒的食管癌细胞的裸鼠与对照组裸鼠相比肿瘤体积较大,且E-cadherin和β-catenin的mRNA和蛋白表达较弱,Vimentin和N-cadherin的mRNA和蛋白表达较强。提示SHOX2基因可促进食管鳞癌细胞的体内生长和转移。结论和意义1.miR-375在食管鳞癌组织中呈低表达,且miR-375可抑制食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和转移能力。2.SHOX2为miR-375直接负向调控的靶基因,且SHOX2可促进食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和转移能力,其表达与患者的预后呈负相关。3.miR-375通过抑制靶基因SHOX2表达,负向调控食管鳞癌细胞的EMT进程。4.综上所述,本课题初步揭示了miR-375,SHOX2与食管鳞癌EMT之间的关系。食管鳞癌组织中miR-375呈低表达,而其负调控的靶基因SHOX2则可能因为miR-375的表达下降而呈高表达状态,进而促进食管鳞癌细胞EMT进程,并且与临床预后呈现负相关关系。MiR-375/SHOX2轴对食管鳞癌细胞EMT进程的负向调控为临床治疗晚期食管鳞癌提供了新的策略和理论依据。