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本文主要从以下几方面进行了论述: 第一部分 目的:探讨脂氧素A4对脂多糖刺激的巨噬细胞增殖和活性氧生成的影响及其可能机制。 方法:体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞,实验分为空白组、脂多糖组(1mg/L脂多糖)、脂氧素处理组(1mg/L脂多糖与0.1~10nmol/L脂氧素A4共同孵育)、重组G-CSF处理组(1mg/L脂多糖、10nmol/L脂氧素A4和0.1mg/L重组G-CSF共同孵育)、G-CSF中和抗体处理组(1mg/L脂多糖、10nmol/L脂氧素A4和0.01mg/L G-CSF中和抗体共同孵育)。实时定量聚合酶链反应(real time PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)分别检测RAW264.7细胞G-CSF基因表达和蛋白分泌水平,CCK-8法检测巨噬细胞的增殖能力,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测活性氧的生成水平,激光共聚焦扫描显微镜技术检测活细胞内游离钙离子浓度的变化,Western Blot检测IκBα磷酸化、降解及NF-κB转位情况 结果:(1)脂氧素A4明显抑制脂多糖诱导巨噬细胞增殖和生成活性氧。(2)脂多糖显著诱导G-CSF基因表达和蛋白分泌(P<0.01),而脂氧素A4明显抑制脂多糖诱导巨噬细胞G-CSF基因表达和蛋白分泌。(3)外源性加入重组G-CSF显著减弱脂氧素A4抑制脂多糖诱导巨噬细胞增殖和活性氧生成的效应,而加入G-CSF中和抗体则加强脂氧素 A4此抑制作用。(4)脂氧素 A4抑制脂多糖诱导的细胞内钙,IκBα磷酸化和降解,NF-κB转位。(5)细胞内钙诱导剂促进IκB磷酸化,并且减弱脂氧素抑制LPS诱导IκB磷酸化的效应。 结论:脂氧素拮抗脂多糖诱导巨噬细胞增殖和活性氧生成依赖于Ca2+–IκB/NF-κB–G-CSF信号通路。 第二部分 目的:炎症在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色,脂氧素是一类重要的内源性抗炎介质。但是迄今为止,关于脂氧素对肿瘤影响的研究仍为空白,本文分别观察了脂氧素对白血病细胞HL-60和K562细胞分化、增殖、凋亡的影响。 方法:体外培养白血病细胞株HL-60和K562,实验分为空白组、各浓度脂氧素处理组。分别用四唑氮蓝NBT还原法和流式细胞术检测HL-60细胞的分化程度及其表面分化标志CD11b和CD14的表达水平;CCK-8法(Cell Counting Kit-8 assay,CCK-8)检测HL-60和K562的增殖能力,PI染色后利用流式细胞仪进行细胞周期分析,Western Blot检测细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E的表达情况;脂氧素对HL-60和K562细胞凋亡的影响通过annexinV试剂盒检测。 结果:(1)NBT还原法和流式细胞术检测提示脂氧素诱导HL-60细胞分化,上调CD11b并增强其NBT还原能力。(2)脂氧素剂量依赖性地抑制HL-60和K562白血病细胞增殖(P<0.05),细胞周期分析发现脂氧素处理组S期细胞比例明显减少而G0/G1期细胞比例增加,Western Blot结果提示脂氧素下调cyclin D1和E。(3)脂氧素呈剂量依赖性地诱导HL-60和K562白血病细胞凋亡。 结论:脂氧素抑制HL-60和K562白血病细胞增殖,诱导G0/G1细胞周期阻滞,促进其分化和凋亡。这为评估脂氧素的抗白血病作用提供重要的实验依据。