【摘 要】
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硒是生物体生命活动的必需微量元素,其主要以硒蛋白的形式发挥生物学作用。硒蛋白W (SelW)是硒蛋白家族的一员,在多种动物的不同组织中均可表达,并且哺乳动物SelW可以作为一
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硒是生物体生命活动的必需微量元素,其主要以硒蛋白的形式发挥生物学作用。硒蛋白W (SelW)是硒蛋白家族的一员,在多种动物的不同组织中均可表达,并且哺乳动物SelW可以作为一种氧化还原酶。目前关于SelW的研究主要集中于哺乳类动物,如灵长类和啮齿类。禽类SelW除组织分布研究的较清楚外,其它知之甚少,尤其是鸡SelW的体外表达方面的研究还未见报道,鸡SelW的生物学作用也研究较少。本研究根据分子生物学技术构建包含3‘UTR区域SECIS在内的鸡SelW真核细胞表达载体和绿色荧光蛋白重组表达载体。通过绿色荧光蛋白重组表达载体对细胞转染条件进行了优化,将鸡SelW真核表达载体转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)细胞中,采用RT-PCR和实时荧光定量PCR (qPCR)技术对转染后的细胞SelW表达情况进行了检测,同时还采用qPCR技术检测了硒蛋白合成相关酶硒代半胱氨酸合成酶(SecS)和硒磷酸化物合成酶(SPS-1) mRNA水平。随后以鸡SelW过表达CHO-K1细胞系和CHO-K1正常细胞为试验对象,采用AO/EB双染和TUNEL方法对不同浓度的过氧化氢诱导的细胞凋亡情况进行检测,同时采用qPCR方法测定过表达细胞系和正常细胞系中Caspase-3、Caspase-8和FasmRNA水平,结果表明：1根据已知鸡SelW cDNA序列,我们设计了能够克隆出鸡SelW SECIS的引物,并成功构建了鸡SelW真核细胞表达载体pcDNA3.1/SelW。2通过限制性内切酶和DNA连接酶,我们成功将pEGFP-N1中的绿色荧光光蛋白基因连接到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)上,构建了重组绿色荧光蛋白表达载体pcDNA3.1/GFP。优化转染试验中,转染试剂和pcDNA3.1/GFP的比例为8:2(μL:ng)时转染效率最高。3本实验成功将鸡SelW转染到CHO-K1细胞中,最适条件是六孔板每孔加入8μL转染试剂和2μg的表达载体。pcDNA3.1/SelW转染24h和48h后,对转染pcDNA3.1/SelW的细胞和未转染pcDNA3.1/SelW的细胞中SelW、SecS和SPS-1mRNA水平进行检测,经琼脂糖凝胶电泳图像显示,转染pcDNA3.1/SelW的细胞中出现了SelW特异性条带,而未转染pcDNA3.1/SelW细胞中没有此条带的出现,同时qPCR显示,转染鸡SelW细胞中的SelW mRNA水平明显高于未转染细胞,说明我们成功构建了鸡SelW过表达细胞系。我们还发现转染鸡SelW细胞的SecS mRNA水平明显增高,SPS-1mRNA水平无明显变化,我们推测SecS参与了鸡SelW的合成,而SPS-1没有。4过氧化氢能够诱导鸡SelW过表达细胞系和正常细胞发生细胞凋亡。经AO/EB双染和TUNEL法检测我们发现,转染鸡SelW细胞的细胞凋亡率明显低于同水平的过氧化氢诱导的未转染细胞,同时对细胞凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8和Fas mRNA水平检测发现,经同浓度过氧化氢诱导的转染鸡SelW的细胞中,Caspase-3、Caspase-8和Fas mRNA水平明显低于未转染细胞,提示鸡SelW能够降低过氧化氢诱导的细胞损伤,在抵御氧化应激中发挥重要作用,具有抗氧化的作用。
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