重组活菌载体疫苗是将所需的特异性抗原基因插入活细菌染色体或质粒载体中，提呈抗原以达到预防一种或多种疾病的新型疫苗。活菌载体疫苗在诱发机体产生黏膜免疫方面具有独特优点，也可产生细胞免疫和体液免疫应答。目前，作为该类疫苗载体的细菌主要是以减毒的微生物(如沙门氏菌)为主，该类疫苗载体存在临床上的毒副作用等问题。因此，有必要研究和建立更加安全有效的新型细菌疫苗载体。 以正常大肠杆菌作为传染病疫苗载体或者肿瘤治疗载体的研究近年来受到了关注。大肠杆菌的遗传背景清楚，在体内无毒副作用，安全性好。其染色体DNA含有4.6×106个碱基，可以作为建立多价疫苗的一种大的载体。 为了解决大肠杆菌的染色体DNA修饰、抗原基因有效表达、没有黏附侵袭能力的问题，本课题从以下四方面开展了研究：一、建立修饰大肠杆菌染色体DNA的技术平台，二、筛选外源基因在染色体上的高效表达位点，三、建立具有黏附和侵袭能力的重组大肠杆菌新菌株，四、重组疫苗载体的动物免疫评价。 本研究首先建立与疫苗制备相关的重组工程技术包括：①基于线型DNA打靶分子的大肠杆菌体内基因剔除技术，②选择与反选择外源基因定位敲入染色体上特定位点技术，③Gap-repair体内克隆技术，④单链DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术，⑤建立“抗生素-酶切位点”选择反选择技术新技术。然后，为解决外源基因有效表达问题，我们选择了大肠杆菌染色体上的6个基因表达位点，将荧光素酶报道基因分别敲入其中，定量分析了外源基因的表达效率，发现在除去阻遏基因lacI后，外源基因能在lac操纵子的lacZ位置高效表达，表达效率明显高于多拷贝质粒。将外源蛋白与改构的外膜蛋白Lpp-ompA融合表达可高效表达并展示于细菌外表面，是活菌载体疫苗理想的抗原表达途径。外源基因在大肠杆菌染色体上的稳定表达并不影响细菌的生长繁殖。同时，为了使正常大肠杆菌获得对真核细胞的黏附和侵袭能力，我们应用重叠引物介导的DNA重组和SacB-抗生素”选择与反选择基因敲入技术分别将长度分别为71bp的南美锥虫(trypanosomecruzi)的黏附基因(P4)、3600bp的假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)的侵袭基因(Inv)或576bp的其C端192个氨基酸的部分片段敲入到大肠杆菌DY330染色体的外膜蛋白基因中，细胞侵袭实验和小鼠体内实验证明新菌株获得了较强的黏附和侵袭能力，能够在体内有效定居，得到外源抗原基因能够在染色体上高效表达、具有黏附侵袭能力的没有毒副作用的新型大肠杆菌疫苗载体。最后，我们将炭疽保护性抗原(PA)基因和霍乱毒素B亚单位(CTB)基因定位敲入该载体染色体的Lpp-ompA融合表达位点，以4×109cfu剂量口服免疫小鼠，ELISA检测结果表明全部免疫组都产生了相应PA和CTB的特异性血清抗体IgG。证明我们所构建的新型重组大肠杆菌活疫苗载体能够在体内有效运输抗原并激发全身特异性体液免疫应答。 我们的实验结果证实了应用重组工程技术修饰大肠杆菌染色体DNA的方法构建活菌载体疫苗是可行的。以大肠杆菌染色体DNA为疫苗载体的策略为抗原在体内的运输提供一种新的途径，也为构建安全有效的多价重组活疫苗提供了新的方法。这些工作为活菌载体疫苗的更深入研究和临床应用提供了重要的理论基础和实验依据。