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[目的]
①建立大鼠主动脉环体外培养血管新生实验模型，观察新生血管生长的特征和规律。以Rho激酶抑制剂法舒地尔(HA-1077)为干预因素，研究HA-1077对血管新生的影响。②建立大鼠主动脉环与干细胞共培养血管新生实验模型，研究经内皮定向诱导分化的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)对动脉环血管新生的影响，以及法舒地尔(HA-1077)的干预作用。
[方法]
1.HA-1077对体外培养大鼠主动脉环血管新生的影响无菌条件下取一段胸主动脉，剪为长约1mm的血管环，随机分为对照组、HA-1077低、中、高浓度组，对照组血管用HG-DMEM+15％FBS的培养液培养，HA-1077组分别在培养液中加入10μmol/L或30μmol/L或60μmol/L HA-1077，每2天换液，每天观察微血管的生长情况。第5天终止实验，拍摄微血管生长图像，计数新生的微血管分支数。同组的血管环合并，组织匀浆，提取激酶，WesternBlot检测ROCKⅠ及ROCKⅡ的表达。
2.大鼠主动脉环与同种异体、经内皮诱导的BMSCs体外共培养对血管新生的影响及HA-1077的干预作用2.1采用密度梯度离心法，用密度=1.077g/ml的淋巴细胞分离液，从大鼠骨髓中分离BMSCs，并于体外纯化、扩增。流式细胞术检测BMSCs的表面标志CD29、CD106以及CD45。
2.2 EGM-2培养液诱导BMSCs10～14d，传代后将诱导的BMSCs接种于明胶包被的玻片，分别行Ⅷ因子免疫细胞化学和荆豆凝集素免疫荧光染色鉴定。
2.3细胞增殖试验：按2×103个/孔将内皮诱导的BMSCs接种于96孔板培养24h，更换含刺激因子的培养液培养24h，采用MTT法，酶标仪490nm检测OD值。每次实验设平行孔4孔，实验重复3次。
2.4干细胞标记：PBS冲洗2遍，将1mL10mg/mL DiI加入到培养瓶中，转入培养箱内孵育40分钟，荧光显微镜观察细胞的标记情况。消化细胞，制备成细胞悬液，备用。
2.5内皮诱导的BMSCs与血管环共培养：无菌条件下取一段胸主动脉，剪为长约1mm的血管环，随机分为空白对照组、实验对照组、HA-1077低、中、高浓度组，空白对照组血管用HG-IDMEM+15％FBS的培养液培养，不加诱导的BMSCs；实验对照组在空白对照组的基础上，加诱导的BMSCs；HA-1077组，在实验对照组的基础上，并分别在培养液中加入10μmol/L，30μmol/L，60μmol/L HA-1077。每2天换液，每天观察微血管的生长情况。第10天终止实验，拍摄微血管生长图像，计数新生的微血管分支数。同组的血管环合并，组织匀浆，提取激酶，Western Blot检测ROCKⅠ及ROCKⅡ的表达。
[结果]
1.HA-1077对体外培养大鼠主动脉环血管新生的影响与对照组比较，HA-1077低浓度组新生微血管数明显增加，P<0.01；中、高浓度组新生微血管数较对照组明显减少，P<0.01。对照组和HA-1077低浓度组都有ROCKⅠ和ROCKⅡ表达，组间比较无明显差异；HA-1077中、高浓度组则基本未见ROCKⅠ或ROCKⅡ表达。
2.大鼠主动脉环与同种异体、经内皮诱导的BMSCs体外共培养对血管新生的影响及HA-1077的干预作用2.1 BMSCs培养2d后，部分贴壁细胞呈梭性，密度均一。7～9d后，贴壁细胞形成多个细胞集落。传代后BMSCs体积较原代时明显增大，呈长梭形，成纤维细胞样。流式细胞术鉴定，CD106阳性细胞达到38.9％，CD29阳性细胞为80.4％，CD45阳性细胞达到29.8％。
2.2经EGM-2诱导BMSCs10～14d后，细胞形态由长梭形向圆形、短梭形、多边形转变；细胞生长至融合后呈鹅卵石样。内皮细胞表面标志，Ⅷ因子和荆豆凝集素试验阳性。
2.3 MTT法检测各组内皮诱导的BMSCs增殖无显著差异。
2.4内皮诱导的BMSCs与血管环共培养：与空白对照组比较，实验对照组(只加诱导的BMSCs组)新生微血管数明显增加，P<0.01。与实验对照组比较，低浓度组、中浓度组、高浓度组新生微血管数明显减少，P<0.01。各组均有ROCKⅠ和ROCKⅡ表达，组间比较无明显差异。
[结论]
1.小剂量的HA-1077促进体外培养的大鼠主动脉环的血管新生。大剂量的HA-1077抑制体外培养的大鼠主动脉环的血管新生，此作用与ROCK蛋白质表达抑制有关。
2.经内皮诱导的同种异体BMSCs与动脉环体外共培养促进血管新生，HA-1077抑制与内皮诱导的BMSCs共培养的主动脉环的血管新生。