古菌Thermoplasma acidophilum6-磷酸海藻糖合成酶的克隆、表达及其性质鉴定

来源 :齐鲁工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zmyswzzxp123654
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6-磷酸海藻糖合成酶在海藻糖代谢过程中发挥重要作用,在 UDP-葡萄糖(UDPG)与葡萄糖-6-磷酸作为底物的参与下,能够将UDP-葡萄糖(UDPG)上的葡萄糖基转移到葡萄糖-6-磷酸上,使产生海藻糖-6-磷酸。本实验我们对嗜热古菌Thermoplasma acidophilum所编码的6-磷酸海藻糖合成酶(taTPS)的性质进行一系列的研究。  我们首先以thermoacidophilic archaeon Thermoplasma acidophilum所编码的TPS基因序列TA1210为依据,克隆、构建质粒并将其导入到大肠杆菌体内进行表达,然后通过金属离子亲和层析以及分子筛层析纯化获得较纯蛋白收集液,然后通过相关实验对其酶学特点做了探究。  taTPS可以利用UDPG、ADPG、GDPG当成糖基供体,以不同磷酸化单糖为糖基受体。研究发现taTPS最适催化温度和pH是60℃和6,并且具有一定的温度稳定性以及酸碱稳定性。研究还发现:二价金属离子对酶的活性也具有一定的影响,硫酸软骨素和肝素钠盐可以提高酶的催化活性。常用的添加剂EDTA、尿素、乙醇、DTT、SDS、β-巯基乙醇、甲醇、异丙醇、正丁醇都能够抑制酶的催化活性,而加入盐酸胍对其催化活性有很强抑制性。  分子建模及其突变研究结果显示N-loop对酶的催化效率有着显著的影响,从而表明了N-loop在不同的6-磷酸海藻糖合成酶内所具有的不同作用。
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