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一、研究背景骨缺损的修复是骨科临床常见和多发的棘手难题之一，传统的自体及异体骨移植一直仍为首选，但均存在各自的缺点。磷酸钙骨水泥(calcium phosphatecements，CPCs)作为新型的骨修复材料，具有可注射、塑形好、骨传导性强等优点，是一种新型自固化人工骨替代材料，但较慢的吸收降解率阻碍了其广泛应用；目前人们在骨组织工程的研究中，期望rhBMP-2的参与能获得比较理想的骨组织再生。但由于将BMP单纯植入机体内扩散太快，并且BMP易被蛋白酶水解，故不能在有效的时间内作用于更多靶细胞，生物学效能难以充分发挥，故BMP的临床应用需要一定的缓释载体。虽然通过将CPC直接负载骨生长因子治疗骨缺损效果良好，但CPC的因子释放能力有限。微球用于药物载体的研究始于20世纪70年代中期，自此以后的研究发展十分迅速。目前生长因子及可降解的微球载体材料生物学的最新成就己经成功运用于软骨、骨以及其他相关组织的组织工程研究中。可降解微球携载因子后复合磷酸钙骨水泥，在微球降解成孔的同时使因子释放率大大增加，明显加速复合材料的降解和诱导成骨。目前主要以PLGA材料制备微球，但它仍存在较为缓慢的降解率及降解产物呈酸性易损伤周围组织细胞的缺点，而明胶微球生物相容性好，降解后形成胶原，无毒副作用，有望代替PLGA作为磷酸钙骨水泥的良好改性材料。二、研究目的采用无毒、可生物降解、生物相容性好的明胶作为载体材料，优化的双相乳化冷凝聚合法制备rhBMP-2/GMS，对其形态、粒径、包封率、载药率进行检测，测定其体外因子缓释曲线，进一步将其负载于磷酸钙骨水泥，制备多孔载因子CPC，在骨缺损模型体内，采用“生物力学特性-X线观察-组织形态”的综合手段，评估新型复合人工骨材料对骨缺损愈合的作用。三、研究内容和方法1基因重组人骨形态发生蛋白-2/明胶微球(rhBMP-2/GMs)的制备及性质检测根据天然明胶材料经京尼平处理后可交联成球及可固化的特性，采用改进的双相乳化冷凝聚合法制备rhBMP-2/GMs ;检测rhBMP-2/GMs载药率及包封率，扫描电镜观察rhBMP-2/GMs形态及粒径。rhBMP-2/GMs体外释药实验研究：以10ml无菌PBS作为释药介质，加入适当浓度的rhBMP-2/GMS溶液1ml，混合均匀后，放置于37℃恒温水浴振荡器中，记录释药起始时间。分别于第1-10天吸取释药介质5ml，ELISA法测试药物含量，并同时补充等量5ml介质，测量每个时间段所释放的药物总量，进行百分比统计，描绘药物累积释药曲线。根据rhBMP-2/GMs载药率和包封率计算出rhBMP-2含量后，以相同比例与CPC混合，分别将rhBMP-2/GMs/CPC组及rhBMP-2/CPC组各以5ml生理盐水作为释药介质，分别于1、4、7、14、21、28天收集全部浸提液，ELISA法测定rhBMP-2的浓度，从而计算出各个时间点的累积释药量，描绘累计释药曲线。2.rhBMP-2/GMs/CPC体内降解、诱导成骨实验制备复合rhBMP-2/GMS/CPC(A组)、GMS/CPC (B组)和rhBMP-2/CPC (C组)，分别植入兔桡骨骨缺损模型中，术后6、12周行大体、X线检查、骨密度检查，术后12周处死动物，收集标本，分别行生物力学测定，脱钙切片、HE染色，不脱钙切片进行荧光显微镜下观察双标间距，计算平均矿化率。3.统计学处理实验结果以x±s表示，组间差异比较分别采用方差分析和q检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异特别显著。四、结果1 rhBMP-2/GMs性质检测结果.形态及粒径：经图像分析仪检测，圆形规则，直径为78±20μm，平均直径为87.8μm。扫描电镜观察固化后的微球表面均匀、圆整，微球之间粘连少，分散性好。载药率及包封率：微球内药物的包封率80.5%，微球载药率为9.8%，即每毫克微球中含98μg。稳定性观察：明胶微球在放置于4℃的恒温冰柜6个月以后，倒置显微镜下观察其外观、形态明显无变化，无明显粘连，再分散性良好，置于生理盐水中后成乳状液，散布均匀，无沉淀。体外释药实验: rhBMP-2/GMs微球释药结果表明微球的体外释药符合双相动力学释药规律，即初相为快速释药相，后相为平稳缓释相。体外释药曲线可见约70%的rhBMP-2在10天左右释放完成。两种复合材料对比释药结果表明：rhBMP-2/GMs/CPC组的24小时体外释放率为8.3±1.5%，随后28天内逐渐缓慢释放，不同时间点的释放率均高于rhBMP-2/CPC组。2 .rhBMP-2/GMs/CPC体内降解、诱导成骨实验X线检查：术后第12周，A组骨缺损修复明显快于B组、C组，且材料降解较B组快。骨密度检测显示术后6周三组未见明显差异，但12周后A组明显高于B、C组。组织病理学提示：术后12周材料周围、邻近区域A组的平均骨矿化率均明显高于B组及C组。HE染色见术后12周A组复合材料大部分降解，内部可见大量新生骨组织生成，新生骨组织的形成量明显高于B组、C组，不脱钙切片观察：A组材料骨界面见双条状新骨荧光着色带且距离较宽，新骨生成较多；B组见骨界面材料荧光着色极少，距离最窄；而C组片状着色且距离相对较窄，说明材料周围新骨生成相对不稳定。五、结论1．探索出:rhBMP-2/GMs的最佳制备方法，所得方法制备工艺稳定，重复性好。2．rhBMP-2/GMs及rhBMP-2/GMs/CPC体外释药实验均证明其具有良好的缓释效果。3. rhBMP-2/GMs复合于磷酸钙骨水泥上的诱导成骨及降解效果分别优于GMS/CPC和rhBMP-2/CPC。4．复合rhBMP-2明胶微球缓释系统在骨组织工程研究中具有广阔的应用前景。