论文部分内容阅读
遗传性出血性毛细血管扩张症(Hereditary hemorrhagic telangiectasia,HHT),也称为郎-奥韦综合征,是一种罕见的常染色体显性遗传病,主要表现为皮肤,粘膜和器官中的血管形成异常。HHT根据突变基因的不同主要分为5类,I型HHT的致病基因是Endoglin,约占该疾病50%。Endoglin是一类位于细胞表面的I型膜糖蛋白,同时也是TGF-β受体复合物的一部分。过去的研究证明了它在血管发育中发挥着至关重要的作用,但是Endoglin调控血管的具体机制以及下游的效应因子依旧缺乏认知。本研究结合斑马鱼动物模型、HHT病人样本,探索Endoglin调控血管发育的机制以及下游效应基因。本研究课题采用的实验方法包括,1.利用斑马鱼为体内模型,显微注射吗啉基寡核苷酸(Morpholino,MO)抑制Endoglin的表达,通过实时荧光定量核酸扩增技术(Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR)、原位杂交(in situ hybridization)、流式细胞荧光分选技术(Fluorescence activated cell sorting,FACS)等方法,研究Endoglin在血管发育的调控机制;2.利用HHT病人来源的诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)定向分化得到内皮细胞(Endothelial cells,ECs)为体外模型,通过蛋白质印迹法(Westernblot)、成管实验(Tube formation)等方法,分析Endoglin下游效应基因作为治疗靶点的可能性。本研究课题主要分为从六个部分展开:1、不同脊椎动物的Endoglin保守性分析:首先我们分析了不同脊椎动物Endoglin氨基酸序列的保守性,结果表明,Endoglin跨膜结构域的氨基酸序列高度相似性。再利用生物信息学工具,比较了不同脊椎动物Endoglin进化的保守性,分析得到斑马鱼和人类的Endoglin来源于同一个祖先;2、Endoglin在斑马鱼早期发育不同时期的表达模式:首先利用RT-qPCR检测了 Endoglin在斑马鱼早期发育不同时期总体表达量,再利用原位杂交检测Endoglin在斑马鱼早期发育不同时期表达的具体位置。结果表明,Endoglin高表达于受精卵时期,随后逐渐表达下降。原肠期以后Endoglin表达再次逐渐上调,最终高表达于血管区域;3、Endoglin的敲低对于血管发育的影响:利用fli携带GFP标记的转基因荧光鱼Tg(flila:EGFP)yl来展示斑马鱼胚胎血管的发育。在morpholino抑制Endoglin的表达后,斑马鱼胚胎血管严重受损。24小时的斑马鱼胚胎,节间血管出现断裂,部分血管甚至消失不见。同时利用FACS筛选出了 Endoglin敲低组、正常组斑马鱼的GFP阳性(GFP+)内皮细胞(fli是一个大家广泛接受的内皮细胞标记物,GFP+细胞可代表内皮细胞),观察到GFP+内皮细胞显著减少;4、Endoglin的敲低对于内皮标记物表达的影响:利用RT-PCR、原位杂交检测了内皮标记物的表达情况(krl、cdh5、hey2、lmo2、pu.1),发现Endoglin的敲低后5种标记物表达显著减少;5、Endoglin潜在的下游效应因子:利用RNA测序技术,筛选出了 Bmper作为Endoglin潜在下游效应因子。我们发现了 Bmper与Endoglin在斑马鱼早期发育的过程中表达模式具有高度的相似性,而且Bmper过表达能够恢复Endoglin敲低组的缺陷血管;6、Bmper作为HHT治疗靶点的可能性分析:利用Western Blot、Tube formation实验分别检测HHT病人来源的ECs中DNA结合蛋白抑制剂1(DNA-bindingprotein inhibitor-1,ID1)的表达以及血管形成能力,发现在BMPER刺激后ECs中ID1表达以及血管形成能力显著上调。总体来说,本研究从发育角度揭示了 Endoglin参与血管发育的过程一Endoglin主要通过影响内皮细胞增殖,从而实现对于斑马鱼血管的调控。此外,本研究首次发现了 BMPER作为下游效应基因参与了血管调控的过程,并且结合HHT病人样本分析了 BMPER作为HHT治疗靶点的可能性,为HHT的临床治疗提供了研究基础。