NCOR2/SMRT参与胆汁酸核受体激活调控溃疡性结肠炎癌变的机制

来源 :北京协和医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:samuraitruong
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第一部分胆汁酸核受体(FXR)通过核受体辅助抑制因子2(NCOR2)参与调节结直肠肿瘤细胞肿瘤特性目的:探究NCOR2在胆汁酸核受体FXR激活对结直肠肿瘤细胞增殖、迁移能力影响中的作用机制。方法:筛选结肠癌细胞Caco2、HT29、HCT116、SW480、SW620及改良的肠黏膜上皮细胞CCD841中FXR及NCOR2蛋白表达水平;采用噻唑兰试验(MTT)验证FXR激动剂GW4064对肿瘤细胞增殖能力的影响;采用免疫共沉淀检测FXR与NCOR2在细胞内相互作用;在构建NCOR2siRNA敲降肿瘤细胞系后,予GW4064干预并采用MTT法检测肿瘤增殖能力,干预48h-72h收取细胞蛋白及RNA,通过Western blot法检测β-catenin表达水平;进行细胞免疫荧光染色并通过激光共聚焦显微镜检测β-catenin表达部位;采用qRT-PCR法检测β-catenin下游基因AXIN2、Cyclin D1及MYC mRNA水平,反映β-catenin转录活性;通过Trans-well法检测GW4064干预对肿瘤细胞迁移能力的影响,通过Western blot法检测E-cadherin、N-cadherin表达水平。结果:(1)FXR 在 Caco2、HT29 中高表达,在 HCT116、SW480、CCD841 中表达略低,在SW620中低表达;NCOR2在HT29、HCT116、SW480中高表达,在Caco2、CCD841 中表达略低。(2)GW4064 显著抑制 Caco2、HT29、HCT116、SW480细胞增殖,且对细胞增殖的抑制在一定范围内随干预浓度升高增强,GW4064对SW620增殖抑制作用不明显。(3)在细胞内,FXR与NCOR2相互作用,且与NCOR2结合的FXR远高于FXR总量的10%,GW4064激动FXR后,FXR与NCOR2结合能力略有下降。(4)在NCOR2敲降的HCT116、SW480细胞系中,GW4064对细胞增殖能力的抑制明显降低。(5)GW4064干预可轻度下调总β-catenin蛋白表达,但在NCOR2敲降的HCT116细胞系,GW4064对下调β-catenin蛋白表达水平的作用不明显。(6)进一步免疫荧光显示GW4064干预细胞β-catenin主要分布于细胞膜及细胞质,且荧光强度略降低;在NCOR2敲降的细胞系,可观测到β-catenin细胞核分布,细胞膜分布水平下降。(7)GW4064干预可下调AXIN2、Cyclin D1 mRNA表达水平,但在NCOR2敲降细胞系,GW4064下调上述mRNA表达不明显。(8)Trans-well试验48h结果显示,GW4064明显促进SW480、HCT116细胞系迁移能力,在NCOR2敲降的细胞系中,细胞迁移未见显著下调。(9)GW4064处理48h未见明显E-cadherin蛋白水平表达改变,未见N-cadherin表达。结论:(1)FXR激动剂GW4064可通过促进FXR与NCOR2共同作用明显抑制结直肠肿瘤细胞增殖能力,对增殖的抑制部分通过下调β-catenin蛋白表达,稳定β-catenin细胞膜及细胞核分布,抑制其入核发挥转录活性作用实现。(2)GW4064可显著提升结直肠肿瘤细胞迁移能力,但未见明显上皮间充质转化发生。第二部分胆汁酸核受体FXR活化抑制小鼠肠炎的机制初探目的:探究胆汁酸核受体FXR激活对DSS诱导的肠炎模型小鼠的抑炎作用,并在单核肿瘤细胞中探讨潜在机制。方法:将18-20g的雄性C57BL6小鼠随机分为3组适应性喂养1周,第1-2组建立DSS诱导的小鼠“肠炎模型”(2.5%DSS饮用水连续服用5天,之后换回常规饮用水)。第2组在建模结束后予5mg/(kg·d)FXR激动剂INT-747灌胃2天;第1组予同等剂量的溶媒灌胃;第3组为空白对照组。3组小鼠均在第7天处死,建模和干预其间每天统计小鼠体重,处死后统计结直肠长度,进行病理学炎症程度评估;采用qRT-PCR法检测小鼠黏膜组织NCOR2、TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA水平,采用免疫组织化学染色法及Western blot法检测黏膜组织NCOR2蛋白表达水平及位置。选用人单核肿瘤细胞系THP1,予FXR激动剂INT747预处理24h后,改为含LPS的培养基培养3h,采用qRT-PCR法检测TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平,采用ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α分泌情况,在NCOR2敲降的THP1细胞系重复上述实验。结果:(1)各组小鼠DSS诱导的结肠炎症程度显示,FXR激动剂INT747灌胃组相较DSS模型对照组,小鼠体重比值(0.86±0.04 vs.0.85±0.02)、结直肠长度(6.1±0.49 vs.5.32±0.47)、黏膜病理组织学评分(11.4±4.4vs.18.0±4.3)均略有改善,但无显著差异(p>0.05);(2)INT747灌胃可下调小鼠肠黏膜部分炎症因子mRNA的表达水平;(3)DSS建模后,小鼠黏膜NCOR2蛋白表达水平略有下降,免疫组织化学染色核阳性率显著下降(58.9±7.8%vs.39.0±5.8%);INT747灌胃对小鼠肠黏膜NCOR2 mRNA及蛋白表达水平无明显影响,但免疫组化提示核染色阳性率明显增加(53.0±6.4%vs 39.0±5.8%);(4)在人单核肿瘤细胞系THP1中,用含终浓度10μM INT747的无血清培养基预处理24h后,可明显缓解LPS诱导的TNF-α、IL-1βmRNA表达水平,下调TNF-α的分泌,但对IL-6 mRNA表达水平无明显影响,在NCOR2敲降的THP1细胞中,INT747预处理对LPS诱导后TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达影响无显著差异。结论:(1)FXR激动剂INT747可改善DSS诱导的小鼠结肠炎炎症程度;(2)INT747对NCOR2蛋白及mRNA表达量无明显影响,但可能抑制NCOR2降解、促进NCOR2核转位;(3)INT747可以抑制THP1单核肿瘤细胞部分炎症因子的合成及释放,该过程可能通过NCOR2实现。
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