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奶牛乳房炎严重影响牛奶产业发展,而细菌性感染是奶牛乳房炎的主要致病因素。由于奶牛细菌性乳房炎不合理或不规范的抗生素治疗,导致动物机体内微生物生态系统的失衡,进一步引起条件性致病菌的感染。由于念珠菌能够利用抗生素作为生长的碳源,过度的抗生素治疗可能导致奶牛真菌性乳房炎的发生。其中形成生物被膜的白色念珠菌可以通过开放的乳导管进入乳腺组织,是奶牛真菌性乳房炎的最常见病原菌。而对氟康唑天然耐药,具有更强大的细胞表面疏水性以及生物被膜形成、分泌酶类能力的克柔念珠菌（C.krusei）性奶牛乳房炎在兽医临床上却常常被忽视。本研究采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）对奶样中的克柔念珠菌进行鉴定,测定分离株毒力因子;采用微量稀释法进行药物敏感性试验;PCR扩增测序检测耐药基因突变,实时定量PCR检测耐药基因及外排泵基因在不同耐药菌株间的表达水平;利用蛋白质组学分析克柔念珠菌酵母相和菌丝相的菌体、上清以及外泌体在蛋白质水平上的表达差异;构建克柔念珠菌两相感染大鼠乳腺模型,HE染色分析酵母相和菌丝相对大鼠乳腺组织损伤的差异并进行炎性细胞因子检测;利用转录组学分析克柔念珠菌酵母相和菌丝相损伤奶牛乳腺上皮细胞（BMEC）s的特征和相关信号通路;进一步通过流式细胞术、蛋白免疫印迹分析等方法验证克柔念珠菌酵母相和菌丝相感染BMECs细胞的损伤分子机制。结果发现（1）牛源克柔念珠菌分离株具有两相性转换能力及强大的细胞表面疏水性,部分分离株同时可以产生磷脂酶、天冬氨酸蛋白酶,具备溶血能力和形成生物被膜能力。分离株除对棘白菌素类没有产生耐药以外,对其他类抗真菌药物均呈现双重耐药性和多重耐药性。分离株ERG11基因中鉴定出3个同义突变和1个错义突变,相对于剂量依赖组和敏感组,伊曲康唑耐药组菌株的ERG11、ABC2基因表达显著上调,ABC1表达无显著差异;分离株FKS1基因HS1片段中鉴定出2个错义突变和1个同义突变,米卡芬净剂量依赖组和敏感组菌株之间FKS1基因表达无显著差异。（2）通过克柔念珠菌酵母相与菌丝相蛋白质组学分析,鉴定出11个已知功能的蛋白基因;两相差异表达蛋白质主要有:Zn（Ⅱ）2Cys6锌簇蛋白、铜离子转运体、ABC转运蛋白、细胞色素P450、泛素羧基末端水解酶、ADP核糖基化因子和延长因子Tu等。（3）大鼠乳房炎模型病理结果显示,酵母相1× 107CFU/mL,1×108CFU/mL,1×109 CFU/mL实验组感染引发乳腺组织的损伤程度适当,均宜造模。菌丝相1×107CFU/mL,1 × 108CFU/mL,1×109 CFU/mL实验组感染均能引发乳腺组织的损伤,但1 × 109 CFU/mL感染组乳腺组织病变过于严重,不宜造模。酵母相刺激大鼠乳腺分泌TNF-α、IL-1β、IL-18的含量显著高于菌丝相,而两相IL-6和IL-8的分泌量基本一致。大鼠乳腺模型中血清白蛋白含量较对照组都显著降低,转铁蛋白含量均显著升高。（4）克柔念珠菌酵母相和菌丝相感染BMECs细胞转录组学分析发现,PDGFRA、GPNMB、MXI1、IGFBP5基因表达上调,SEMA7A、CSF2基因表达下调,功能主要涉及细胞蛋白质磷酸化、细胞凋亡及增殖、细胞因子调节等;通过KEGG分析发现,差异表达基因主要富集在凋亡、自噬、MAPK、PI3K-Akt和FoxO等信号通路。（5）通过细胞超微结构观察发现,克柔念珠菌两相不仅粘附细胞,菌丝相还可以侵入及穿透细胞膜,引起细胞严重的变形和细胞间连接断裂,引起细胞凋亡和自噬,且菌丝相诱导自噬发生率高于酵母相;克柔念珠菌感染细胞导致LDH释放量显著升高,且与时间呈现正相关（P＜0.01）;流式细胞术检测发现,克柔念珠菌两相均可以引起BMECs细胞的凋亡和坏死,但菌丝相的坏死率明显高于酵母相,克柔念珠菌两相感染BMECs细胞线粒体膜电位均极显著降低,但ROS的积累量没有显著增加;TUNEL检测结果显示克柔念珠菌感染细胞调亡率与流式细胞术检测结果一致;蛋白免疫印迹分析表明克柔念珠菌感染可显著增强凋亡、坏死和自噬通路主要蛋白的表达量,显著降低焦亡通路主要蛋白和连接蛋白的表达量,两相能显著增强TLR2受体的表达量,菌丝相能显著增强TLR4受体的表达量;分子机制研究表明克柔念珠菌酵母相可以通过线粒体途径诱导BMECs细胞的凋亡,克柔念珠菌菌丝相可以通过死亡配体/受体途径诱导BMECs细胞的凋亡;TLR2/ERK信号通路参与了细胞凋亡和后期自噬的调控,TLR2/ERK/NF-KB信号通路参与了细胞炎症反应的调控;JNK信号通路参与了细胞凋亡的调控。通过以上研究,得出以下结论:（1）15株牛源克柔念珠菌分离株具有两相性转换能力及强大的细胞表面疏水性,部分分离株同时可以产生磷脂酶、天冬氨酸蛋白酶,具备溶血能力和形成生物被膜能力。牛源克柔念珠菌分离株对唑类药物的耐药性与耐药基因突变,耐药基因和外排泵基因过表达有关。（2）克柔念珠菌酵母相和菌丝相在蛋白质种类、表达丰度、翻译后修饰等存在明显差异。（3）克柔念珠菌两相可以粘附和侵入BMECs细胞和大鼠乳腺组织,对BMECs细胞产生明显的细胞毒性作用,导致大鼠乳腺发生慢性炎性反应,且菌丝相引发的损伤程度强于酵母相。（4）克柔念珠菌两相都可以诱导BMECs细胞发生凋亡、坏死和自噬,线粒体途径参与介导克柔念珠菌酵母相诱导BMECs细胞的凋亡,死亡配体/受体途径参与介导克柔念珠菌菌丝相诱导BMECs细胞的凋亡。TLR2/ERK信号通路参与BMECs细胞凋亡和后期自噬的调控,TLR2/ERK/NF-κB信号通路参与BMECs细胞炎症反应的调控;JNK信号通路参与BMECs细胞凋亡的调控。