论文部分内容阅读
虫霉目真菌能够在蚜虫种群中引发流行病，在蚜虫自然防控中起着举足轻重的作用。新蚜虫疠霉（Pandora neoaphidis）是一种在世界范围内最为广泛分布的蚜虫专化病原真菌，在前期的研究中发现新蚜虫疠霉中存在一种革兰氏阴性内生细菌醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus），通过荧光原位杂交以及柯赫氏法则证实了与新蚜虫疠霉的共生关系，并且饲喂醋酸钙不动杆菌进入桃蚜体内能从肠道扩散到脂滴内而存活，而内生细菌在新蚜虫疠霉侵入蚜虫体内后的“菌——虫”免疫互作中的作用尚不清楚。全基因组测序表明蚜虫缺乏应对革兰氏阴性菌的核心免疫成分，基于蚜虫这一特殊的免疫背景，本文以豌豆蚜出发开展豌豆蚜免疫应答新蚜虫疠霉内生细菌侵染的研究，主要结果如下：
一、豌豆蚜品系筛选及建立以及血细胞观察
分别对来自不同地区的豌豆蚜品系进行共生菌鉴定，筛选获得只含有一种次级共生菌Serratia symbiotica的蚜虫品系，并命名为LL1S，同时提取该品系豌豆蚜的血淋巴，并对3种主要的血细胞进行了形态学观察。
二、注射两种革兰氏阴性菌后豌豆蚜存活率及PO活性指标测定
通过已建立的人工注射接种技术体系，对LL1S品系豌豆蚜进行了细菌注射侵染实验。通过对蚜虫存活率的观测及酚氧化酶（phendoxidase，PO）活性指标的检测，发现注射类黄假单胞菌（Pseudomonas synxantha，PS）的豌豆蚜的存活率要显著低于注射醋酸钙不动杆菌（A.calcoaceticus，AC）的豌豆蚜，且在48h内全部死亡；而注射醋酸钙不动杆菌的蚜虫在72h后存活率下降趋势较快。对豌豆蚜血细胞碎片的PO活性进行检测后发现，注射类黄假单胞菌12h与0h相比，PO活性显著上升（P＜0.05），而注射醋酸钙不动杆菌的蚜虫血淋巴的PO活性在0-12h内均无显著变化。而在注射两种革兰氏阴性细菌后的豌豆蚜血细胞裂解液中的PO活性均无明显差异，且均处于较低水平。
三、饲喂两种革兰氏阴性菌后豌豆蚜存活率及PO活性指标测定
通过菌液饲喂侵染测定豌豆蚜的存活率以及PO活性指标，结果表明饲喂类黄假单胞菌和醋酸钙不动杆菌后的豌豆蚜存活率均无显著下降，而酚氧化酶活性在饲喂类黄假单胞菌12h之后对比醋酸钙不动杆菌显著升高，而饲喂醋酸钙不动杆菌同注射结果一样，在侵染前后PO活性无显著变化。结合上述注射侵染方式的结果来看，类黄假单胞菌可能对豌豆蚜具有更为强力的侵染力，进入豌豆蚜体内能迅速增殖扩散，在这期间能够激活酚氧化酶系统，引起豌豆蚜血淋巴PO活性的改变，而醋酸钙不动杆菌的入侵可能无法激活酚氧化酶系统。
四、注射两种革兰氏阴性菌后豌豆蚜转录组分析
通过RNA-seq技术对注射类黄假单胞菌（PS）和醋酸钙不动杆菌（AC）的豌豆蚜分别进行测序分析，以注射PBS作为阴性对照，豌豆蚜基因组序列为参考序列，检测各处理组的基因表达情况。在PBS-AC中，共有2471个DEGs富集在44个GO terms中，显著富集的有代谢过程、细胞过程、大分子生物合成的过程、细胞、胞质、结构分子活性等；共有2272个DEGs被注释到44条KEGG通路中，其中上调DEGs有1167个，下调的有1105个。DEGs上调的几个通路分别为产热通路、MAPK通路、上皮细胞细菌入侵通路等；DEGs下调的通路包括Toll/IMD信号通路、MAPK信号通路、细胞内吞通路等。在PBS-PS中，共有个762个DEGs富集在37个GO terms中，显著富集的有代谢过程、细胞过程、刺激反应、信号传递、膜部分、催化活性等；共有1311个DEGs被注释到44条KEGG通路中，其中上调DEGs有588个，下调的有723个。上调DEGs主要集中在产热通路、蛋白酶体通路、氧化磷酸化通路等；下调DEGs主要集中在Toll/IMD信号通路、MAPK信号通路，细胞粘附分子通路等。
五、不同处理组豌豆蚜免疫相关差异表达基因筛选
对注射类黄假单胞菌（PS）和醋酸钙不动杆菌（AC）的两种处理组豌豆蚜进行免疫相关DEGs筛选，在PBS-AC中共筛选到了94个免疫和应激反应相关差异表达基因，包括组织蛋白酶家族，丝氨酸蛋白酶家族，双氧化酶、超氧化物歧化酶、过氧化物还原酶、C型凝集素、热激蛋白、谷胱甘肽转移酶、巨噬细胞迁移抑制因子等。在PBS-PS中共筛选到了32个免疫相关DEGs，与PBS-AC不同的是发现了一个酚氧化酶原基因PPO1的上调表达。为了探究两种菌所引起的共同免疫相关DEGs，将PBS-AC的94个免疫相关DEGs与PBS-PS的32个免疫相关DEGs进行比对，发现有27个共表达的DEGs，主要为丝氨酸蛋白酶家族、组织蛋白酶家族以及Toll通路中的相关基因。
为了进一步对比注射PS和AC后蚜虫的差异表达基因情况，同样对AC-PS的DEGs进行了分析，筛选出了51个免疫相关DEGs，跟27个共表达DEGs比对筛选出8个显著差异的免疫相关基因，包括4个上调DEGs和4个下调DEGs。这8个基因表示在PS组与AC组不同的免疫差异基因。这为两种菌侵染引起的差异表达研究奠定了分子学基础。
综上所述，本研究通过注射、饲喂两种革兰氏阴性细菌后，豌豆蚜LL1S品系在PO活性等生理生化水平的反应，以及注射类黄假单胞菌（PS）和醋酸钙不动杆菌（AC）的转录组分析，获得的结果初步验证了我们的推测：蚜虫免疫系统对革兰氏阴性细菌存在一定的“免疫豁免”，得到的结论可能有助于解释内生细菌影响新蚜虫疠霉致病力的原因，也可为以内生细菌逃避寄主蚜虫免疫反应的机理为出发点设计新的害虫防治策略提供理论依据。
一、豌豆蚜品系筛选及建立以及血细胞观察
分别对来自不同地区的豌豆蚜品系进行共生菌鉴定，筛选获得只含有一种次级共生菌Serratia symbiotica的蚜虫品系，并命名为LL1S，同时提取该品系豌豆蚜的血淋巴，并对3种主要的血细胞进行了形态学观察。
二、注射两种革兰氏阴性菌后豌豆蚜存活率及PO活性指标测定
通过已建立的人工注射接种技术体系，对LL1S品系豌豆蚜进行了细菌注射侵染实验。通过对蚜虫存活率的观测及酚氧化酶（phendoxidase，PO）活性指标的检测，发现注射类黄假单胞菌（Pseudomonas synxantha，PS）的豌豆蚜的存活率要显著低于注射醋酸钙不动杆菌（A.calcoaceticus，AC）的豌豆蚜，且在48h内全部死亡；而注射醋酸钙不动杆菌的蚜虫在72h后存活率下降趋势较快。对豌豆蚜血细胞碎片的PO活性进行检测后发现，注射类黄假单胞菌12h与0h相比，PO活性显著上升（P＜0.05），而注射醋酸钙不动杆菌的蚜虫血淋巴的PO活性在0-12h内均无显著变化。而在注射两种革兰氏阴性细菌后的豌豆蚜血细胞裂解液中的PO活性均无明显差异，且均处于较低水平。
三、饲喂两种革兰氏阴性菌后豌豆蚜存活率及PO活性指标测定
通过菌液饲喂侵染测定豌豆蚜的存活率以及PO活性指标，结果表明饲喂类黄假单胞菌和醋酸钙不动杆菌后的豌豆蚜存活率均无显著下降，而酚氧化酶活性在饲喂类黄假单胞菌12h之后对比醋酸钙不动杆菌显著升高，而饲喂醋酸钙不动杆菌同注射结果一样，在侵染前后PO活性无显著变化。结合上述注射侵染方式的结果来看，类黄假单胞菌可能对豌豆蚜具有更为强力的侵染力，进入豌豆蚜体内能迅速增殖扩散，在这期间能够激活酚氧化酶系统，引起豌豆蚜血淋巴PO活性的改变，而醋酸钙不动杆菌的入侵可能无法激活酚氧化酶系统。
四、注射两种革兰氏阴性菌后豌豆蚜转录组分析
通过RNA-seq技术对注射类黄假单胞菌（PS）和醋酸钙不动杆菌（AC）的豌豆蚜分别进行测序分析，以注射PBS作为阴性对照，豌豆蚜基因组序列为参考序列，检测各处理组的基因表达情况。在PBS-AC中，共有2471个DEGs富集在44个GO terms中，显著富集的有代谢过程、细胞过程、大分子生物合成的过程、细胞、胞质、结构分子活性等；共有2272个DEGs被注释到44条KEGG通路中，其中上调DEGs有1167个，下调的有1105个。DEGs上调的几个通路分别为产热通路、MAPK通路、上皮细胞细菌入侵通路等；DEGs下调的通路包括Toll/IMD信号通路、MAPK信号通路、细胞内吞通路等。在PBS-PS中，共有个762个DEGs富集在37个GO terms中，显著富集的有代谢过程、细胞过程、刺激反应、信号传递、膜部分、催化活性等；共有1311个DEGs被注释到44条KEGG通路中，其中上调DEGs有588个，下调的有723个。上调DEGs主要集中在产热通路、蛋白酶体通路、氧化磷酸化通路等；下调DEGs主要集中在Toll/IMD信号通路、MAPK信号通路，细胞粘附分子通路等。
五、不同处理组豌豆蚜免疫相关差异表达基因筛选
对注射类黄假单胞菌（PS）和醋酸钙不动杆菌（AC）的两种处理组豌豆蚜进行免疫相关DEGs筛选，在PBS-AC中共筛选到了94个免疫和应激反应相关差异表达基因，包括组织蛋白酶家族，丝氨酸蛋白酶家族，双氧化酶、超氧化物歧化酶、过氧化物还原酶、C型凝集素、热激蛋白、谷胱甘肽转移酶、巨噬细胞迁移抑制因子等。在PBS-PS中共筛选到了32个免疫相关DEGs，与PBS-AC不同的是发现了一个酚氧化酶原基因PPO1的上调表达。为了探究两种菌所引起的共同免疫相关DEGs，将PBS-AC的94个免疫相关DEGs与PBS-PS的32个免疫相关DEGs进行比对，发现有27个共表达的DEGs，主要为丝氨酸蛋白酶家族、组织蛋白酶家族以及Toll通路中的相关基因。
为了进一步对比注射PS和AC后蚜虫的差异表达基因情况，同样对AC-PS的DEGs进行了分析，筛选出了51个免疫相关DEGs，跟27个共表达DEGs比对筛选出8个显著差异的免疫相关基因，包括4个上调DEGs和4个下调DEGs。这8个基因表示在PS组与AC组不同的免疫差异基因。这为两种菌侵染引起的差异表达研究奠定了分子学基础。
综上所述，本研究通过注射、饲喂两种革兰氏阴性细菌后，豌豆蚜LL1S品系在PO活性等生理生化水平的反应，以及注射类黄假单胞菌（PS）和醋酸钙不动杆菌（AC）的转录组分析，获得的结果初步验证了我们的推测：蚜虫免疫系统对革兰氏阴性细菌存在一定的“免疫豁免”，得到的结论可能有助于解释内生细菌影响新蚜虫疠霉致病力的原因，也可为以内生细菌逃避寄主蚜虫免疫反应的机理为出发点设计新的害虫防治策略提供理论依据。