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目的:探讨Ang-(1-7)对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用是否通过抑制内质网应激途径,并进一步探讨其是否通过Akt信号转导通路起作用。方法:1.H9C2心肌细胞培养、传代、种板,建立心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型;2.6孔板中细胞密度达80%以上时,根据实验方案加入Ang-(1-7):(1)对照组(Control):不加任何干预;(2)H/R组:缺氧3小时,复氧6小时;(3)Ang-(1-7)+H/R组:给予1000nM Ang-(1-7)培养细胞,孵育30分钟,之后再缺氧3小时,复氧6小时;检测各组细胞凋亡情况:分光光度法检测caspase3活性、Western blotting检测凋亡蛋白(BIM、p-Bcl-2)相对表达量。3.6孔板中细胞密度达80%以上时,根据实验方案分别加入Ang-(1-7)和(或)Akt-siRNA干预:(1)对照组(Control):不加任何干预;(2)H/R组:缺氧3小时,复氧6小时;(3)Ang-(1-7)+H/R组:给予1000nM Ang-(1-7)培养细胞,孵育30分钟,之后再缺氧3小时,复氧6小时;(4)Ang-(1-7)+Akt-siRNA+H/R组:先加Akt-siRNA孵育30分钟,然后加入1000nM Ang-(1-7)培养30分钟,之后再缺氧3小时,复氧6小时;(5)Akt-siRNA+H/R组:先加入Akt-siRNA孵育30分钟,之后缺氧3小时,复氧6小时。首先检测各组Akt、p-Akt蛋白相对表达量,评价Akt-siRNA干扰效果;之后检测各组细胞凋亡情况(分光光度法检测caspase3活性、Western blotting法检测凋亡蛋白Bcl-2、BIM、p-Bcl-2相对表达量);检测细胞上清液CK-MB含量(ELISA法);检测各组细胞内质网应激相关蛋白表达情况(Western blotting法检测内质网应激蛋白CHOP、caspase12、p-JNK相对表达量);检测心肌细胞SERCA活性;检测各组心肌细胞内钙离子浓度。结果:1检测Ang-(1-7)对细胞凋亡的影响:1.1检测各组细胞Caspase3活性,结果示:与Control组相比,H/R组相对OD值明显增加(P<0.01);与H/R组相比,Ang-(1-7)+H/R组相对OD值明显减小(P<0.01)。1.2 Western blotting检测各组凋亡蛋白相对表达量,结果示:与Control组相比,H/R组BIM、p-Bcl-2相对表达量明显增加(P<0.01);与H/R组相比,Ang-(1-7)+H/R组BIM、p-Bcl-2相对表达量明显减少(P<0.01)。2检测Ang-(1-7)对通路四个关键点的影响:2.1评价干扰效果:Western blotting检测各组Akt、p-Akt相对表达量,结果示:各组细胞内Akt相对表达量无统计学差异(P>0.05)。与Ang-(1-7)+H/R组相比,Ang-(1-7)+Akt-siRNA+H/R组p-Akt相对表达量明显减少(P<0.01);与H/R组相比,Akt-siRNA+H/R组p-Akt相对表达量减少(P<0.01)。2.2多层次检测Ang-(1-7)对各组心肌细胞凋亡的影响2.2.1分光光度法检测各组心肌细胞Caspase3活性,结果示:与Control组相比,H/R组相对OD值明显增加(P<0.01);与H/R组相比,Ang-(1-7)+H/R组相对OD值明显减小(P<0.01),Akt-siRNA+H/R组无统计学差异(P>0.05);与Ang-(1-7)+H/R组相比,Ang-(1-7)+Akt-siRNA+H/R组相对OD值显著增加(P<0.01)。2.2.2 Western blotting检测各组细胞凋亡相关蛋白的相对表达量,结果示:与Control组相比,H/R组Bcl-2相对表达量显著减少(P<0.01),BIM、p-Bcl-2相对表达量明显增加(P<0.01);与H/R组相比,Ang-(1-7)+H/R组的Bcl-2相对表达量显著增加(P<0.01),BIM、p-Bcl-2相对表达量明显减少(P<0.01);与Ang-(1-7)+H/R组相比,Ang-(1-7)+Akt-siRNA+H/R组Bcl-2相对表达量显著减少(P<0.01),BIM、p-Bcl-2相对表达量明显增加(P<0.01)。2.3 ELISA测定各组细胞上清液CK-MB含量,结果示:与Control组相比,H/R组含量显著增加(P<0.01);与H/R组相比,Ang-(1-7)+H/R组含量显著减少(P<0.01),Akt-siRNA+H/R组CK-MB含量差异无统计学意义(P>0.05);与Ang-(1-7)+H/R组相比,Ang-(1-7)+Akt-siRNA+H/R组含量显著增加(P<0.01)。2.4 Western blotting检测内质网应激相关蛋白,结果示:与Control组相比,H/R组CHOP、Caspase12、p-JNK的相对表达量显著增加(P<0.01);与H/R组相比,Ang-(1-7)+H/R组CHOP、Caspase12、p-JNK的相对表达量显著减少(P<0.01),Akt-siRNA+H/R组caspase12的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05);与Ang-(1-7)+H/R组相比,Ang-(1-7)+Akt-siRNA+H/R组CHOP、Caspase12、p-JNK的相对表达量显著增加(P<0.01)。2.5检测心肌细胞SERCA活性,结果示:与Control组相比,H/R组心肌细胞SERCA明显降低(P<0.01);与H/R组相比,Ang-(1-7)+H/R组心肌细胞SERCA明显增高(P<0.01),Akt-siRNA+H/R组心肌细胞SERCA差异无统计学意义(P>0.05);与Ang-(1-7)+H/R组相比,Ang-(1-7)+Akt-siRNA+H/R组心肌细胞SERCA明显降低(P<0.01)。2.6荧光探针Fluo-3/AM检测细胞内钙离子浓度,结果示:与Control组相比,H/R组平均荧光强度明显增高;与H/R组相比,Ang-(1-7)+H/R组平均荧光强度明显减小;与Ang-(1-7)+H/R组相比,Ang-(1-7)+Akt-siRNA+H/R组平均荧光强度明显增高。结论:1.Ang-(1-7)可减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤时的细胞凋亡。2.心肌细胞缺氧复氧损伤时,Ang-(1-7)可通过“PI3K/Akt—SERCA—内质网应激—凋亡”通路对心肌细胞缺氧复氧损伤起保护作用。即Ang-(1-7)能激活Akt信号转导通路,改善SERCA活性,稳定细胞内钙浓度,抑制内质网应激,减少内质网应激凋亡诱导的细胞凋亡。