关节软骨缺损是指累及软骨表层甚至软骨下骨的软骨损伤,可由创伤、退行性变、赘生物、先天性畸形等引起。创伤是导致关节软骨缺损的最常见原因,主要是由于运动或意外事故造成。随着竞技体育日趋激烈、交通日益发达以及人口老龄化问题的日渐突出,使得罹患关节软骨缺损的病例不断增加。由于关节软骨缺乏血管神经支配的组织学和生物学特性限制了其自我修复能力,软骨缺损的治疗一直是临床骨科医生面临的难题。关节软骨缺损的修复尤其是对较大面积缺损的修复,尚缺乏理想的方法,随着科学技术的发展和组织工程学的兴起,使关节软骨缺损的修复取得了一定的进展。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)具有增殖能力强,可多向分化,且采集方便、对机体损伤小的特点,是软骨组织工程理想的种子细胞。应用BMSCs进行回植诱导分化修复关节软骨缺损取得了良好的临床效果。然而,目前的研究大多集中于如何更有效促进BMSCs的软骨分化,如何提高BMSCs的软骨修复效果,对于BMSCs软骨分化中的不良暴露因素的研究甚少。当前,我国已成为全球最大的烟草生产国,吸烟人口亦居世界第一,因吸烟所致的各种疾病及死亡人数逐年上升。流行病学研究发现,尼古丁滥用是影响自体软骨细胞移植修复软骨缺损临床效果的不良因素之一,但其是否同样可影响BMSCs的软骨缺损修复尚未见报道。本实验室前期研究发现,尼古丁持续暴露4周可显著抑制大鼠BMSCs体外软骨定向分化中的蛋白多糖合成和软骨标志基因表达,但其具体机制仍不明确。Y染色体性别决定结构域转录因子(SRY-type high mobility group box9, Sox9)是软骨形成的起始因子,在软骨发生和发育过程中与软骨表型基因的增强子区结合,促进软骨表型基因表达并维持软骨细胞特性。α7烟碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7-nAchR)是一类存在于MSC中典型的离子通道,可调控胞内Ca2+浓度。钙调神经磷酸酶(Calcineurin, CaN)是唯一受Ca2+调控的磷酸酶,其活化可调节活化的T细胞核因子2 (nuclear factor of activated T cell 2, NFATc2)的磷酸化状态,进而调控下游信号通路的功能。表遗传修饰是指影响基因转录活性而不涉及DNA序列改变的基因表达调控方式,其最常见的形式为组蛋白乙酰化修饰。组蛋白乙酰化状态主要由组蛋白乙酰化修饰酶调控,与基因的表达调控密切相关,组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶之间的动态平衡维持着基因的正常表达。因此,我们认为尼古丁可能通过a7-nAchR调节Ca2+/CaN/NFAT通路,导致Sox9表遗传发生变化,进而影响BMSCs的软骨分化。本研究首先从动物水平证实尼古丁对BMSCs修复软骨缺损的不良干预作用,其机制可能是通过抑制Sox9的表达实现其干预作用。然后在前期研究的基础上,从细胞水平证实尼古丁通过表遗传修饰抑制Sox9表达进而影响BMSCs软骨分化的分子机制。进一步利用工具药及RNA干扰技术,阐明尼古丁抑制BMSCs软骨分化的可能的分子靶标。本研究对于尼古丁依赖人群软骨缺损临床治疗风险评估,指导个性化治疗方案,最大程度上避免尼古丁对BMSCs软骨修复的不利影响,实现高质量的关节软骨组织修复,具有重要的理论和现实意义,同时也为指导软骨组织工程在临床中应用提供研究依据。第一部分尼古丁对大鼠BMSCs修复软骨缺损的干预作用研究目的：通过大鼠软骨缺损模型,证实尼古丁对BMSCs软骨缺损修复的干预作用,该干预作用可能通过抑制Sox9表达实现。方法：全骨髓贴壁法分离提取Wistars大鼠BMSCs,传代培养至第三代。取12周龄Wistars大鼠40只,雌雄各半,给予10%水合氯醛(3.5 ml/Kg)腹腔注射麻醉,于右侧股骨滑车处制做直径3.0 mm,深度1.5 mm的软骨缺损模型。将大鼠随机分为4组：缺损对照组(Non-treated):软骨缺损造模后未给予任何修复处理；凝胶修复组(Alginate):软骨缺损造模并海藻酸钠凝胶修复；凝胶+干细胞修复组(BMSCs):软骨缺损造模并复合BMSCs的海藻酸钠凝胶修复；凝胶+干细胞修复+尼古丁处理组(Nicotine):软骨缺损造模并复合BMSCs的海藻酸钠凝胶修复,术后每日分2次给予总量为2.0 mg/kg的尼古丁皮下注射。术后3月麻醉下处死大鼠并取股骨远端标本,取部分标本先观察缺损修复的大体观并行ICRS评分,后制做切片予以组织病理学检测,评估缺损修复效果并行组织学评分。免疫组化检测修复组织中Col2A1、Sox9表达。剩余标本取缺损处修复组织,提取总RNA, PCR检测软骨表型基因(Col2A1和Aggrecan)及Sox9表达。结果：大体观与组织学检测显示,缺损对照组可见修复的软骨组织,深度与周围软骨基本平齐,软骨表面可见明显的缺损及溃疡；HE及番红固绿染色可见修复组织为纤维软骨样组织,基质染色明显变浅。凝胶修复组可见部分修复的软骨组织,面积为缺损的1/2以上,深度接近周围正常软骨,软骨表面可见较大的裂隙存在；HE及番红固绿染色未见基质染色,修复组织为非软骨组织。凝胶+干细胞修复组软骨缺损完全修复,深度与周围软骨平齐；软骨表明光滑；HE及番红固绿染色可见其为透明软骨组织,软骨基质染色与周围正常软骨无差异。凝胶+干细胞修复+尼古丁处理组软骨缺损基本修复,深度基本与周围软骨平齐；软骨表面未见明显缺损,部分呈纤维软骨样改变；HE及番红固绿染色可见大部分为透明软骨样组织,软骨基质染色较周围正常软骨浅。ICRS评分显示凝胶+干细胞修复组高于其他组(P<0.05),组织学评分显示凝胶+干细胞修复组低于其他组(P<0.05)。免疫组化染色显示,缺损对照组修复组织中Col2A1染色较淡,Sox9阳性染色细胞数量少；凝胶修复组Col2A1未见染色,未见Sox9阳性染色细胞；凝胶+干细胞修复组染色明显,Sox9阳性染色细胞数量较多；凝胶+干细胞修复+尼古丁处理组染色Col2A1也较淡,Sox9阳性染色细胞数量较少。光密度分析结果表明,凝胶+干细胞修复组Col2A1、Sox9的MOD值较凝胶+干细胞修复+尼古丁处理组高(P<0.01,P<0.05)。软骨表型基因mRNA表达显示,凝胶+干细胞修复组Col2A1、Aggrecan及Sox9的mRNA表达均高于凝胶+干细胞修复+尼古丁处理组(P<0.05)。结论：海藻酸钠凝胶复合BMSCs移植可良好修复软骨缺损,尼古丁可对其修复效果产生不利影响,不良干预作用可能通过抑制Sox9表达实现。第二部分尼古丁抑制大鼠BMSCs软骨分化的表观遗传转录调控机制研究目的：在细胞水平证实尼古丁抑制BMSCs软骨分化的表观遗传转录调控机制。方法：采用海藻酸钠微球三维培养方法,对BMSCs进行软骨诱导分化28天,分化过程中每日给予不同浓度(0、0.1、1、10、100(?)M)尼古丁处理,PCR检测软骨表型基因及Sox9的mRNA表达。取P3代BMSCs,提取蛋白及总RNA,PCR和Western Blotting筛选验证烟碱受体(nicotinic acetylcholine receptor, nAchR)亚型。Fluo-3AM孵育BMSCs,给予上述不同浓度尼古丁处理,激光共聚焦检测细胞内Ca2+浓度变化的时间与幅度,并采用发色底物法检测细胞内CaN活性变化。尼古丁分别处理BMSCs8h、16 h及24 h,检测Sox9的表达变化,根据Sox9的表达发生变化的时间确定尼古丁处理时间。给予不同浓度尼古丁处理BMSCs验证其表遗传机制,提取总蛋白与核蛋白检测NFATc2表达,提取浆蛋白,检测磷酸化的NFATc2表达。进一步采用染色质免疫共沉淀方法(chromatin immunoprecipitation, ChIP)检测Sox9基因启动子区H3K9、H3K14乙酰化修饰、NFATc2与Sox9启动子区结合以及Sox9与Col2A1增强子区结合情况,应用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, co-IP)检测NFATc2与组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase, HDAC1) 的相互作用。结果：BMSCs上存在a7-nAChR.给予尼古丁刺激后细胞内Ca2+浓度在5-10min内呈浓度依赖性升高,CaN活性亦呈浓度依赖性增强(P<0.05)。尼古丁处理BMSCs24 h后,Sox9表达明显降低。胞核中去磷酸化的NFATc2表达升高(P<0.01,P<0.05),胞浆中磷酸化的NFATc2表达下降(P<0.01,P<0.05),细胞总蛋白中NFATc2表达无明显差异。NFATc2与Sox9启动子区结合增强(P<0.01, P<0.05), Sox9启动子区组蛋白H3K9、H3K14乙酰化水平下降(P<0.01, P<0.05),Sox9与Col2A1增强子区结合下降(P<0.01,P<0.05)。HDAC1与NFATc2的结合增强。尼古丁处理导致的以上改变均呈现出浓度依赖性变化的特点。结论：尼古丁对BMSCs软骨分化抑制的表遗传调控机制主要是通过α7-nAChR使Ca2+浓度上升并活化CaN,使NFATc2去磷酸化入核,与Sox9启动子区结合并招募HDAC1,从而使Sox9启动子区乙酰化下降抑制Sox9表达,进而与Col2A1增强子区结合下降,使软骨表型基因表达下降从而抑制软骨分化。第三部分尼古丁抑制大鼠BMSCs软骨分化的分子靶标研究目的：利用α7-nAChR特异性抑制剂甲基牛扁亭碱(methyllycaconitine, MLA)及Si-NFATc2在细胞水平确证尼古丁抑制BMSCs软骨分化的分子靶标。方法：取P3代BMSCs按第二部分方法进行软骨诱导分化28天,随机分为4组：对照组(Control):给予正常软骨分化培养；尼古丁处理组(Nicotine):每日给予100(?)M尼古丁处理；(3)MLA处理组：每日给予10(?)M的MLA处理；(4)MLA+尼古丁处理组：每日先给予MLA处理0.5 h,再给予100(?)M尼古丁处理。检测软骨表型基因及Sox9的mRNA表达,番红O和阿利新蓝特殊染色进行形态学检测。为进一步明确分子机制的作用靶标,将BMSCs分为4组：对照组(Control):给予正常软骨分化培养24h；尼古丁处理组(Nicotine):给予100(?)M尼古丁处理24 h; Si-NFATc2处理组(Si)：先给予Si-NFATc2处理24 h,再给予100(?)M尼古丁处理24 h; MLA处理组(MLA)：先给予MLA处理0.5 h,再给予100(?)M尼古丁处理24 h。采用第二部分中方法检测BMSCs中Ca2+浓度变化、Sox9基因启动子区H3K9、H3K14乙酰化修饰、NFATc2与Sox9启动子区结合、Sox9与Col2A1增强子区结合以及HDAC1与NFATc2的结合情况。结果：软骨诱导分化28天后,与对照组相比,尼古丁处理组软骨基质阿利新蓝及番红O染色明显变浅,MLA处理组及MLA+尼古丁处理组基质染色无明显变化；尼古丁处理组软骨表型基因及Sox9的mRNA表达明显下降(P<0.01),MLA处理组及MLA+尼古丁处理组无明显变化。机制靶标验证结果显示,尼古丁组Sox9的mRNA与蛋白表达明显下降(P<0.01),Sox9表达无明显变化。尼古丁处理后Ca2+浓度升高,MLA及尼古丁处理后Ca2+浓度无明显变化。与对照组相比,尼古丁组Sox9启动子区组蛋白H3K9、H3K14乙酰化显著下降(P<0.01),Sox9与Col2A1增强子区结合下降(P<0.01);MLA处理组及Si-NFATc2处理组Sox9启动子区组蛋白H3K9、H3K14乙酰化水平及Sox9与Col2A1增强子区结合无明显变化(P<0.01)。MLA处理组及Si-NFATc2处理组NFATc2与HDAC1均未出现明显结合的增强。结论：α7-nAChR及NFATc2是尼古丁软骨分化抑制作用的分子机制靶标,针对以上靶标进行干预可逆转尼古丁对BMSCs软骨分化的抑制作用。