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一、目的检测LncRNANNT-AS1骨肉瘤组织与骨肉瘤细胞系中的表达水平,分析其表达与临床病理特征的相关性。进一步通过体外细胞系功能及体内OS-732裸鼠荷瘤模型进行实验探讨LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤发生发展过程中的作用及相关机制。二、材料与方法首先检测了 LncRNA NNT-AS1在47例骨肉瘤组织中的表达,随后检测了其在永生化的成骨细胞以及骨肉瘤细胞系中的表达水平。体外研究,首先采用CCK-8实验以及克隆形成实验检测干扰LncRNA NNT-AS1的内源性表达之后细胞增殖能力;随后使用流式细胞术分析了干扰LncRNA NNT-AS1后,骨肉瘤细胞的凋亡,细胞周期分布水平;同时使用了 Transwell实验分析了干扰LncRNA NNT-AS1后细胞的侵袭能力以及增殖、转移相关关键蛋白的表达变化。体内研究,将内源性LncRNA NNT-AS1下调的OS-732细胞皮下注射到裸鼠腋下,按时间点测量裸鼠体重与移植瘤大小。5周后处死裸鼠,切取移植瘤瘤体组织检测移植瘤组织中肿瘤增殖的情况(通过C-Myc染色)。三、结果1.LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤组织、细胞中显著上调使用实时定量PCR技术检测并分析LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤组织以及瘤旁骨组织中的表达,LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤组织中上调,并与Enneking分期相关。随后发现LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤细胞系中亦上调,提示LncRNA NNT-AS1可能作为一个原癌基因参与了骨肉瘤的发生、发展。2.体外实验探讨LncRNA NNT-AS1的生物学功能使用CCK-8实验以及克隆形成实验检测干扰LncRNA NNT-AS1的内源性表达之后细胞增殖能力,使用流式细胞术检测干扰LncRNA NNT-AS1的内源性表达后细胞的凋亡,细胞周期分布水平。结果显示,干扰LncRNA NNT-AS1可显著降低细胞的增殖能力,促进凋亡以及阻滞细胞周期。3.体外实验探讨LncRNA NNT-AS1对骨肉瘤细胞的侵袭能力Transwell小室实验检测下调LncRNA NNT-AS1的内源性表达后对骨肉瘤细胞侵袭能力变化的影响。此外,采用Western blot实验用检测增殖、凋亡相关基因的变化。结果提示干扰LncRNA NNT-AS1后,骨肉瘤细胞的侵袭能力下降,伴随着增殖、凋亡蛋白水平的改变。4.干扰LncRNA NNT-AS1可减小鼠成瘤能力为了进一步探讨LncRNA NNT-AS1在体内的作用,我们使用OS-732骨肉瘤细胞系建立裸鼠模型并分为2组:1、对照转染组;2、LncRNA NNT-AS1干扰组。肿瘤增长曲线显示干扰LncRNA NNT-AS1可明显减小肿瘤生长体积。通过对移植瘤组织的免疫组化染色分析我们发现LncRNA NNT-AS1下调组内肿瘤组织的增殖能力明显低于对照转染组(C-Myc染色)。这些结果提示LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤发生、发展过程中扮演着重要的角色。四、结论1、LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤组织中显著上调,扮演着原癌基因的角色;2、干扰LncRNA NNT-AS1能影响骨肉瘤细胞凋亡以及细胞周期的改变,从而有效抑制骨肉瘤细胞增殖;3、体内实验表明干扰LncRNA NNT-AS1抑制成瘤能力。