研究背景和目的结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,近年来由于经济水平提高,人民生活方式发生很大变化,结直肠癌的发生率和死亡率明显上升,其中发生率在世界上位列第三,在中国位列第四。结直肠癌的发生发展是一个多基因,多步骤的复杂过程,转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因,阐明结直肠癌的转移机制,寻找有效的预防及治疗途径是结直肠癌的研究重点。EMT (Epithelial-mesenchymal transition)上皮间质转化是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞,并获得一定的转移能力的生物学过程。在胚胎发育、组织发生等过程中起着重要作用,同时人们发现其在慢性炎症,组织重建及肿瘤转移等多种疾病过程中承担着重要角色。通过EMT转化,上皮细胞失去了细胞极性,失去与基底膜的连接等上皮表型,获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型,其特征有上皮标记分子(E-cad、角蛋白等)表达减少,间叶标记分子(vimentin、N-cad等)表达升高,细胞角蛋白为主的细胞骨架转化为波形蛋白为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等。在肿瘤中的研究表明EMT与肿瘤转移密切相关,比如在结直肠癌、肝癌、肺癌中已发现E-Cad的表达与肿瘤的转移及预后呈相关关系。EMT的信号转导调控是通过与细胞表面特异性受体结合而将信号转导入细胞内,通过细胞内的TGF-β,RAC、soc、Rho、PI3K/AKT、Wint等信号转导途径来调节。RhO家族为Ras超家族中的蛋白,属于小G蛋白家族的亚家族,具有GTP酶活性,分子量大约为20-25KD,目前已经发现了20多个Rho家族成员,主要分为Rho、Rac、CdC42及缺乏GTP酶活性等四大类。研究表明Rho家族成员是细胞内多条信号通路的的关键分子,作为分子开关在细胞信号转导中发挥了重要的作用,参与正常细胞增殖、分化、凋亡等多个生理过程的调节。近年来的研究发现RhoGTP酶在多种恶性肿瘤中高表达,其表达的改变可影响肿瘤细胞的侵袭和转移过程,并与细胞骨架改变有关。TM4SF1(Transmembrane4L6family member1)基因位于人3号染色体(3q21-3q25)。其编码的蛋白TM4SF1是一种低分子量糖蛋白,相对分子量约为21KDa～28KDa,1992年由Marken克隆并鉴定,全长为202氨基酸。TM4SF1是L6家族成员,最初被认为是四次跨膜蛋白家族成员。其家族成员还包含TM4SF4、TM4SF5、TM4SF18、TM4SF19、TM4SF20。TM4SF1参与血管内皮细胞伪足的的形成并促进血管的生成；TM4SF1被募集到TERM区,参与肿瘤细胞生长、活化及转移的调控。TM4SF1在多种肿瘤如肺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌及前列腺癌肿瘤中高表达,并与肿瘤的侵袭及转移相关。为了寻找标志结直肠癌进展和转移的特异性分子,我们前期应用基因芯片从不同转移潜能的结直肠癌细胞株中筛选出具有差异表达的TM4SF1基因作为我们的研究对象。在本研究中我们讨论TM4SF1与结直肠癌的关系及在结直肠癌增殖、侵袭、转移中的作用；初步探讨影响结直肠癌细胞生物学特性的分子机制,为结直肠癌的临床诊治、药物筛选及预后判断等奠定基础。方法1.应用免疫荧光实验检测TM4SF1蛋白在细胞中的定位；应用免疫组化实验检测189例结直肠癌病人石蜡切片标本中TM4SF1蛋白表达；采用Real-time PCR实验检测28例结直肠癌病人新鲜癌及癌旁组织中mRNA表达；采用western blot实验检测14对病人新鲜癌及癌旁组织中TM4SF1蛋白表达；应用western blot实验检测8株结直肠癌细胞株中TM4SF1蛋白表达；应用spssl3.0软件分析TM4SF1的表达水平及其与临床病理特性之间的关系。2.构建TM4SF1真核表达载体(SW480/TM4SF1)和其对照载体(SW480/NC)及慢病毒干扰载体(M5/shTM4SF1)和其对照载体M5/NC)。将转化好的细菌涂板,挑取单克隆小摇及大摇细菌,按照中提试剂盒说明书提取载体。用Lip2000介导瞬时转染SW480和M5细胞,分别用G418和嘌呤霉素筛选稳定细胞株,2周后挑取单克隆细胞团至6孔板并扩大培养。3.应用CCK8及平板克隆实验检测细胞的体外增殖能力,应用划痕及transwell实验检测细胞体外迁移能力,采用侵袭实验检测细胞体外侵袭能力。采用裸鼠皮下成瘤实验检测细胞体内增殖能力,鼠尾静脉注实验检测细胞体内转移能力。4.倒置显微镜下观察过表达及干扰TM4SF1后细胞形态的变化。应用westernblot方法检测过表达及扰TM4SF1后EMT相关标志蛋白及Rho家族蛋白表达变化。采用电镜实验观察过表达及干扰TM4SF1后细胞伪足的变化。结果1.TM4SF1在结直肠癌组织中的表达及与临床病理特性相关分析免疫荧光实验结果显示TM4SF1蛋白定位于细胞膜和细胞浆。对189例病人的结直肠癌标本进行免疫组化,结果显示,TM4SF1在正常组织中不表达或低表达,在癌组织远处转移,淋巴结转移中高表达。对结直肠癌患者的临床病理特性进行研究,结果显示TM4SF1与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置以及分化程度等无关,与肿瘤的侵袭(P=0.006)、淋巴结转移(P=0.001)、远隔转移(P=0.003)及Duke’s分期(P<0.001)有关。Real-time PCR实验结果显示,28对结直肠癌组织中,癌内TM4SF1mRNA表达水平高于癌旁组织(P=0.036)。Western blot实验结果表明14对癌及癌旁组织中,TM4SF1蛋白在癌组织中高表达,而癌旁组织中低表达。2.TM4SF1在结直肠癌细胞株中的表达对结直肠癌细胞株SW480、SW620、HCT116、LS174T、LOVO、DLD1、HT29、M5进行Western blot实验,结果显示TM4SF1在不同的细胞株中蛋白表达不同。其在低转移潜能细胞株中低表达,而在高转移潜能细胞株中高表达。3.上调TM4SF1表达促进细胞的增殖、迁移及侵袭能力构建TM4SF1过表达真核载体及对照(NC)载体,用Lip2000介导转染SW480细胞,用G418筛选稳定过表达细胞株,2周后挑取单隆至六孔板,采用westernblot实验进行鉴定,得到稳定过表达细胞株(SW480/TM4SF1)及对照株(SW480/NC)。平板克隆实验结果显示,过表达组细胞克隆形成数量明显多于对照组,(t=13.587,P<0.001)；cck8实验结果显示,过表达组细胞体外增殖能力明显强于对照组(F=5761.34,P<0.001),说明TM4SF1过表达后促进细胞的体外增殖能力。Transwell实验结果显示,过表达组细胞穿过小室的数量多于对照组(t=43.355,P<0.001),划痕实验结果显示,过表达组细胞划痕愈合能力明显快‘于对照组,说明过表达TM4SF1后促进细胞的体外迁移能力。侵袭实验结果显示,过表达组细胞穿过小室数量多于对照组(t=17.454,p<0.001),说明过表达TM4SF1促进细胞的体外侵袭能力。裸鼠皮下成瘤实验结果显示过表达组细胞皮下成瘤能力增强,(F=4.81,P=0.033)；裸鼠尾静脉实验结果显示,过表达组肺成瘤裸鼠数量多于对照组,且肺内转移瘤数量多于对照组,说明过表达TM4SF1后促进细胞的体内增殖及转移能力。4.下调TM4SF1表达抑制细胞的增殖、迁移及侵袭能力构建TM4SF1慢病毒干扰载体及对照(NC)载体,用Lip2000介导转染M5细胞,用进嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选,2周后挑取单隆至六孔板,采用westernblot实验进行鉴定,得到稳定干扰细胞株(M5/shTM4SF1)及对照株(M5/NC)。平板克隆实验结果显示,干扰组细胞克隆形成数量明显少于对照组(t=28.126,P<0.001),cck8实验结果显示,干扰组细胞增殖能力明显低于对照组(F=424.361,P<0.001),说明干扰TM4SF1表达抑制细胞的体外增殖能力。Transwell实验显示干扰组细胞穿过小室数量明显少于对照组(t=31.678,P<0.001),划痕实验结果显示,干扰组细胞划痕愈合速度明显慢于对照组,说明过干扰TM4SF1后抑制细胞的体外迁移能力。侵袭实验结果显示,干扰组细胞穿过小室的数量明显少于对照组(t=12.751,P<0.001)。说明干扰TM4SF1后抑制细胞细胞的体外侵袭能力。裸鼠皮下成瘤实验结果显示,干扰组细胞的皮下成瘤能力低于对照组(F=10.42,P=0.002),裸鼠尾静脉实验结果显示,干扰组肺成瘤的裸鼠数量少于对照组,且肺内转移瘤数量少于对照组,说明干扰TM4SF1后抑制细胞的体内增殖及转移能力。5.过表达及干扰TM4SF1对结直肠癌细胞EMT的影响倒置显微镜观察过表达后细胞形态的变化,结果显示过表达TM4SF1后细胞形态出现梭形化趋势。Western blot检测过表达及干扰TM4SF1后EMT标志物的表达变化。过表达TM4SF1后上皮标志物E-Cad表达下降,粘附分子Zol-1表达下降,间质标志物N-Cad、vimentin表达上升,β-catenin及转录因子sail表达没有变化。干扰TM4SF1表达后上皮标志物E-Cad表达上升,粘附分子Zol-1表达上升,间质标志物N-Cad、vimentin表达下降,β-catenin及转录因子sail表达没有变化。说明过表达TM4SF1促进细胞发生EMT。5.过表达及干扰TM4SF1后结直肠癌细胞Rho家族蛋白表达变化应用westernblot实验检测过表达及干扰TM4SF1后细胞株中Rho家族蛋白表达变化,结果显示,过表达TM4SF1后总RhoA蛋白表达升高,干扰后总RhoA蛋白表达下降；过表达及干扰TM4SF1后总Racl及cdc42蛋白表达没有变化。7.过表达及干扰TM4SF1后细胞伪足变化应用电镜实验观察过表达及干扰TM4SF1后细胞伪足变化,结果显示,过表达TM4SF1后细胞伪足变长且数量增多；干扰TM4SF1后细胞伪足变短且数量减少。结论1. TM4SF1在结直肠癌中高表达且与Ducks分期、淋巴结转移、远处转移成正相关。2. TM4SF1可促进结直肠癌细胞体内外的增殖、侵袭及转移。3. TM4SF1可能通过激活Rho信号通路介导EMT的发生而参与调控结直肠癌细胞的侵袭与转移。4.TM4SF1有可能成为判断结直肠癌患者进展及预后的一个新的分子标志物,为结直肠癌的预后及治疗提供了新的分子靶点。本研究的创新之处1.研究结果提示TM4SF1可促进结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。2.TM4SF1可能通过激活Rho信号通路介导EMT的发生而参与调控结直肠癌细胞的侵袭与转移。