脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是国内外医学界面临的一个紧迫问题。随着全球经济、现代化和交通的发展,引起脊髓损伤的事故越来越多,给家庭和社会带来了沉重的负担。目前的研究领域集中在对导致脊髓损伤的病理生理过程的有效干预。最近的研究已经确定了血氧化酶-1（Heme Oxygenase-1,HO-1）在继发性脊髓损伤中的作用。血红素氧化酶-1广泛存在于机体组织和细胞内,组织损伤或者应激状态下的缺氧、水肿等因素也会诱导血红素氧化酶-1的表达,但是脊髓损伤继发性损伤过程中,血红素氧化酶-1表达的变化,目前缺乏大量研究验证。内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS）是细胞对刺激的反应性变化:内质网应激发生时,细胞本体可以通过调节代谢反应和减少抑制内质网蛋白质加工和运输的压力来促进内质网的更新。然而若内质网应激反应过强,细胞保护机制可能难以抗衡应激损伤,细胞凋亡等负面病理生理过程进一步发展,会造成继发损伤进一步加重。对于脊髓损伤而言,明确脊髓损伤继发性损伤过程中的内质网应激变化过程,从中寻找平衡点,也是探寻脊髓损伤治疗措施的切入点之一。凋亡（Apoptosis）是细胞的程序性死亡,由特定的基因介导的过程激活,以保持压力下身体内部环境的稳定。有研究发现,机体内环境平衡遭到破坏时,凋亡可由促凋亡转录因子CHOP的激活和内质网相关的Caspase-12的激活触发的,而这一切的发生可能与内质网应激过度有关。血红素氧化酶-1在生理状态下,通常在细胞质内的内质网中表达,并起到生理作用。对来自外部环境的特定刺激作出反应,例如,其羧基末端可能会发生脱落,从而导致它的重新定位,调控相关基因表达,实现降低环境刺激应激对细胞的损伤。核转位后,血红素氧化酶-1可以通过激活血管内皮生长因子转录活性,从而实现促进其在细胞中的分泌;也可以抑制内质网应激诱导的内皮细胞凋亡,促进血管修复。而这些作用可能与血-脊髓屏障的调节作用相关。综上,血红素氧化酶-1与内质网应激关键蛋白在脊髓损伤后,随时间点变化,表达变化的相关性,其脊髓损伤治疗保护作用与内质网应激和诱导凋亡的调控作用,及与其对血-脊髓屏障的调节作用效果,并且它们之间是否存在更深一步的相互作用机制,仍缺乏相应研究。因此,依据上述问题,本实验从三个部分探讨验证:1.大鼠脊髓损伤后HO-1表达的变化及其与脊髓损伤后内质网应激变化之间的关系;2.运用SD大鼠制作脊髓损伤模型,使用腺病毒介导的HO-1干预治疗,探究证实HO-1对大鼠脊髓损伤模型中的治疗保护作用,其与内质网应激介导细胞凋亡的关系及机制;3.通过体外血脊髓屏障缺氧模型来验证核血红素氧化酶-1对缺氧诱导后体外血脊髓屏障通透性的影响及机制。目的:通过在动物和细胞层面的一系列分子生物学研究,通过分子生物学、行为学和形态学实验来研究脊髓损伤后的分子机制变化,HO-1对脊髓损伤的作用及作用机理、脊髓损伤后HO-1和内质网应激的作用及其对血-脊髓屏障的作用机制等问题进行了探究分析;为揭示了HO-1在脊髓损中的作用与作用机制,为脊髓损伤的研究提供理论基础和实验科学依据,为治疗脊髓损伤提供新的方法和思路。研究方法:第一部分:运用Allen’s法制作大鼠脊髓损伤打击模型,按照处理方式及取材时间不同分为（SHAM组、4h组、12h组、1d组、3d组、7d组）通过蛋白质印迹法检测脊髓损伤后不同时间点的血红素氧化酶-1以及内质网应激关键蛋白（GRP78、C-Caspase-12、CHOP）表达的变化,通过Pearson相关系数分析血红素氧化酶-1与内质网应激关键蛋白在脊髓损伤后,随时间点变化,表达变化的相关性。第二部分:通过Allen’s法制作大鼠脊髓损伤模型,分为SHAM组、SCI组、Ad-GFP组和HO-1组,其中Ad-GFP组和HO-1组分别为脊髓损伤模型基础上给予相应治疗干预处理;脊髓损伤后,使用BBB运动功能评分、Nissl染色和HE染色来评估运动恢复情况,组织结构和神经元损伤情况。通过Western Blot和Tunel染色,分别分析了各处理组的内质网应激相关蛋白（GRP78、C-Caspase-12、CHOP）和凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2）的表达,验证内质网应激和凋亡的变化;分别通过Western Blot和免疫荧光染色,检测胞浆和胞核中HO-1表达变化情况。第三部分:运用HCMEC/D3细胞系和HA-sc细胞系通过Transwell构建体外血脊髓屏障,并通过转染与化学性缺氧诱导构建损伤模型,分为HO-1CΔ23组、空载组和空白对照组,Western blot检测HO-1CΔ23组和空白对照组中HO-1蛋白在细胞核内和细胞浆内表达的变化;HRP检测各组血脊髓屏障通透性变化;分别用Western Blot和免疫荧光染色检测各组CAV-1、CAV-2蛋白表达的变化;分别用Western Blot和免疫荧光染色检测各组ZO-1和Occludin蛋白表达的变化。结果:第一部分:随脊髓损伤后的时间,HO-1表达也发生了变化,脊髓损伤后4小时,HO-1的表达明显高于假手术组,并在脊髓损伤后3天左右达到最高。HO-1的表达在大约3天时是最高的,然后逐渐减少。随着脊髓损伤后时间变化,与假手术组相比,内质网应激相关蛋白（GRP78、C-caspase-12和CHOP）的表达水平在脊髓损伤4小时后明显升高,并在大约3天后达到一个表达高峰,随后逐渐下降。脊髓损伤后HO-1和内质网表达随时间的变化有一致的趋势,推测脊髓损伤后HO-1表达变化和内质网应激变化相关,HO-1可能参与脊髓损伤后内质网应激反应的调节。第二部分:BBB大鼠运动功能评分结果显示,脊髓损伤后模型组大鼠运动功能均受到严重限制,但随时间变化,HO-1组大鼠运动功能评分较其他组明显有提升。Nissl染色显示,脊髓损伤后的大鼠脊髓前角的神经元数量明显低于假手术的大鼠,表明这一现象导致了脊髓损伤后的运动功能障碍;Ad-GFP空载组与脊髓损伤组相比,无明显改善;而HO-1组显著提升了脊髓前角神经元数量。HE染色显示脊髓损伤后有明显的组织损伤,并有空洞形成,空洞面积与脊髓截面面积比在损伤组和Ad-GFP空载组无明显差异,然而在HO-1组面积可见有显著减小,提示HO-1对脊髓损伤后组织损伤也有治疗改善作用。Western Blot检测结果提示脊髓损伤后,内质网相关蛋白（GRP78、C-Caspase-12、CHOP）表达较比假手术组均有明显的增加;Ad-GFP空载组与脊髓损伤组相比无明显变化,而HO-1组显著降低内质网应激相关蛋白的表达。Western Blot检测结果发现,各干预组对细胞凋亡相关蛋白表达具有不同的调节作用,其中凋亡蛋白Bax在脊髓损伤组和Ad-GFP空载组中表达明显增高,而抑凋亡蛋白Bcl-2在该两组中表达明显下降,提示脊髓损伤后,细胞凋亡水平增加。而相反的,HO-1组中与损伤组相比,Bax表达明显下降而Bcl-2表达明显增高,整体结果提示HO-1干预能抑制脊髓损伤后的细胞凋亡。Tunel凋亡荧光染色结果与Western Blot结果趋势相一致。Western Blot检测结果发现,脊髓损伤后HO-1表达的上调也可以导致胞浆内HO-1表达的增加,提示HO-1的干预,可以诱导HO-1核转移,亦即“核HO-1”。相应的,免疫荧光染色检验空载组和HO-1组中HO-1蛋白在细胞核内和细胞浆内表达的变化,结果可见与相应的Western Blot检验结果相符合。第三部分:Western Blot检测两组HCMEC/D3细胞核HO-1及细胞浆HO-1变化情况,与空白对照组相比,HO-1CΔ23组的核HO-1表达明显增加,但两组的胞浆HO-1表达没有统计学意义。HRP检测各组血脊髓屏障渗透率,结果显示:与空载组及空白对照组比较,HO-1CΔ23组通透性明显下降。Western Blot检测各组CAV-1及CAV-2蛋白变化情况与空载组及空白对照比较,HO-1CΔ23组CAV-1及CAV-2蛋白表达明显减少,CAV-1和CAV-2蛋白的表达水平在空载组和空对照组之间没有明显差异。CAV-1和CAV-2蛋白的免疫荧光分析与Western Blot结果一致。在HO-1CΔ23组,与空载组和空白对照组相比,ZO-1和Occludin的表达明显增加。与对照组相比,空载组的ZO-1和Occludin表达明显增加,而与空白对照组没有发现明显的差异。用免疫荧光法检测Occludin蛋白,结果与Western Blot结果一致。结论:第一部分:脊髓损伤后HO-1的表达随时间变化,与内质网应激相关蛋白表达的变化相吻合;HO-1与脊髓损伤后内质网应激蛋白表达的变化有关,HO-1可能参与了脊髓损伤后内质网应激反应的调节。第二部分:HO-1改善了脊髓组织的损伤,促进了脊髓损伤后运动功能的恢复;HO-1可以抑制内质网应激相关蛋白的表达,抑制脊髓损伤后的细胞凋亡,证实对脊髓损伤后的保护作用可能部分是通过抑制内质网应激诱导的细胞凋亡途径来实现的;脊髓损伤后,HO-1发生核转位,胞核中HO-1的表达较损伤前明显增高,具体作用有待进一步研究。第三部分:脊髓损伤后,血红素氧化酶-1表达上调的治疗保护作用,与其发生核转位,亦即“核HO-1”有关;“核HO-1”可以降低血-脊髓屏障通透性,维持脊髓微环境的稳定性,实现对脊髓损伤的保护作用;“核HO-1”作用机制主要如下:（1）通过减少脊髓损伤后血-脊髓屏障质膜微囊数量;（2）通过干预调节细胞旁途径的功能。