论文部分内容阅读
随着学科交叉的发展,科学家可以实现在分子水平上对生物体内缺陷基因组的修复,基因治疗也逐步从体外实验向体内临床实验不断拓展。基因治疗是在体外事先对特定基因碱基对重排,加载到基因载体,注射入生物体并进入细胞内实现基因表达,修复缺失基因组。基因载体作为基因传递的媒介尤为重要,基因载体一般可分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体的优点在于基因表达效率高,缺点是工业化生产难度大和免疫安全存在不确定性,另外病毒载体还存在自身基因变异的可能性。基于上述原因限制了病毒载体的应用,科学家对非病毒基的载体,特别是化学基因载体开展了大量研究工作。多年研究发现,阳离子脂质体和阳离子活性剂可以通过库仑引力与带负电荷的DNA分子绑定,有效压缩DNA分子空间构象。但由于阳离子表面活性剂的生物毒性以及阳离子脂质体和阳离子表面活性剂与DNA分子结合的不可控性,限制了两种基因载体的广泛应用。烷基氧化胺型两性表面活性剂具有pH响应和低毒性等特点,作为基因载体有很好的应用潜力。对其研究主要集中在改变外部环境的pH值来调控烷基氧化胺型两性表面活性剂由非离子态向阳离子态的转变,进而达到控制其压缩DNA的目的。目前,如何将DNA从烷基氧化胺聚集体载体上释放出来的研究较少。本文通过构筑烷基氧化胺型两性表面活性剂无盐体系,构筑DNA/两性烷基氧化胺表面活性剂组装体,深入研究DNA分子与其聚集体相互作用的机理和调控条件,取得了精准控制烷基氧化胺型两性表面活性剂聚集体基因载体对DNA分子进行加载和释放的效果。本论文的结构安排和研究内容如下：第一部分,绪论。介绍了基因治疗的概念、基因载体的种类及其优缺点：总结了各种表征基因载体与DNA分子相互作用的方法和手段；综述了基因载体研究进展;通过对比引出了本论文课题选题依据、研究内容和意义。第二部分,研究了质子化后不同疏水碳链长度的烷基二甲基氧化胺(CnDMAOH+)聚集体对DNA分子的捕捉与释放。当CnDMAOH+的浓度达到临界缔合浓度(cac)时,溶液中出现CnDMAOH+/DNA复合物沉淀。当C10DMAOH+. C12DMAOH+、C14DMAOH+浓度分别达到8.1.6.0.9 mmol·L-1时,溶液中的DNA分子几乎全部被CnDMAOH+聚集体捕捉形成CnDMAOH+/DNA复合物沉淀。值得关注的是,当继续加入过量的CnDMAOH+,溶液中CnDMAOH+/DNA复合物沉淀再溶解,释放出游离的DNA分子。此时C10DMAOH+、C12DMAOH+、C14DMAOH+浓度分别为40、9、1.8mmol·L-1溶液pH约为4。这种现象归因于CnDMAOH+分子间以及其与CnDMAO分子间可以形成氢键,氢键屏蔽了CnDMAOH+聚集体和DNA分子间的静电引力。该方法实现了单一控制·CnDMAOH+浓度即可实现对DNA分子的捕捉与释放。为了对比该方法相对于传统方法的优势,我们还研究了加入β-CD或阴离子表面活性剂SDS实现DNA分子可控捕捉与释放的效果。通过对比实验,验证了单一控制CnDMAOH+浓度对DNA分子的捕捉与释放的方法可操作性更强,可控性更精准。该体系表明了CnDMAOH+聚集体作为基因载体的应用潜力,提供了基因载体使用方法的新思路。第三部分,利用Tris-HCl缓冲溶液随温度上升,pH值下降的特性,研究了通过调控溶液温度来达到控制两性表面活性剂烷基二甲基氧化胺(CnDMAO)在Tris-HCl溶液中的质子化,从而进一步控制质子化后CnDMAOH+对DNA分子的捕捉与释放。当温度为25℃时,DNA/C14DMAO的TTris-HCl缓冲溶液(pH=7.2)是澄清的,这说明DNA分子在溶液中主要是游离状态,被C14DMAO聚集体捕捉的量很少。随着溶液温度的上升,溶液pH值随之下降,诱导C14DMAO发生质子化,溶液浊度明显上升,意味着质子化后的C14DMAOH+与DNA分子有很强的结合能力。我们进一步研究了DNA/C14DMAOH+复合物的形成,运用紫外-可见光谱、圆二色光谱(CD)、原子力显微镜(AFM)、动态光散射(DLS)、琼脂糖凝胶电泳(AGE)等测试表征手段,验证了DNA分子被有效捕捉并压缩。值得注意的是,当溶液温度由37℃回到25℃时,DNA分子由被压缩的状态恢复到未压缩的伸展状态。这种升温压缩及降温释放的过程可以持续几个循环,且没有明显的效率下降现象。我们也研究了在Tris-HCl缓冲溶液中,疏水碳链链长对CnDMAO捕捉与释放DNA过程的影响。当以C12DMAO替代C14DMAO时,在DNA/C2DMAO体系中观察到类似的实验现象。不同的是,配制DNA/C12DMAO体系样品使用的是pH=6.8的Tris-HCl缓冲溶液,在DNA/C12DMAO体系中压缩DNA分子时溶液的温度也要稍高于DNA/C14DMAO体系。但是在DNA/C10DMAO体系中,即使我们使用pH值更低的Tris-HCl缓冲溶液(pH=6.6)配制样品,加大C10DMAO的浓度到40 mmol·L-1,也未能观察到DNA分子被压缩的现象。究其原因是由于C10DMAO疏水碳链链长较短,临界胶束浓度较高,在实验条件下,没有形成足以压缩DNA的C10DMAOH+胶束。这一结果表明：对DNA分子的有效捕捉和释放,除了受到DNA与CnDMAOH+之间的静电引力影响以外,还会受到表面活性剂疏水碳链之间疏水作用力的影响。该研究在可控温度响应型基因传递及药物释放等方面具有潜在的应用价值。第四部分,研究了月桂酸(LA)与十四烷基二甲基氧化胺(C14DMAO)形成的无盐阴／阳离子表面活性剂混合体系。通过调控LA与C14DMAO的比例,该体系表现出丰富的聚集行为。运用冷冻蚀刻透射电子显微镜(FF-TEM)和偏光显微镜观察,结合差示扫描量热(DSC)、流变、2H NMR测定,对体系聚集行为和微观结构进行了研究,发现两者在水溶液中可自组装形成胶束(L1)、层状相(Lα1)、囊泡(Lαv)和凝胶相。以胶束相和层状相为软模板通过还原氯金酸,制备了金纳米材料,并利用透射电镜(TEM)与能谱仪(EDS)对其形貌和成分进行了表征。与传统阳离子表面活性剂溶液制备金纳米材料相比,该体系自身具有还原性而不需加入硼氢化钠等还原剂。实验证明：还原过程不会破坏模板溶液原有微观结构,且可通过调控模板溶液的聚集体结构实现控制制备金纳米材料形貌的目的。HK-2细胞的噻唑蓝(MTT)比色法实验进一步证明,该体系制备的球形金纳米材料作为基因载体具有高效和低毒的特点,在基因治疗中具有潜在的实际应用价值,可为寻求安全可靠的基因治疗途径提供实验数据和理论参考。