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蛋白的检测一直是学者们关注的热点话题,高灵敏度的蛋白检测对于基础生物学研究和临床诊断都具有重要的意义。目前报道的文献中蛋白检测方法主要是利用抗体探针介导的,不能达到灵敏快速的检测要求。适配体是使用SELEX技术从随机寡核苷酸库中筛选出的能与靶分子特异结合的短的DNA或者RNA片段.适配体与靶分子比如蛋白,血脂以及小分子物质等结合具有高亲合力及强特异性,因此具有广泛的应用价值。相比抗体适配体有很多的优点,能被简单快速的筛选出来,可以被化学物质标记,易于储存并且不容易被降解等等。
近年来,各种利用适配体的蛋白检测文章被报道。这些方法和各种检测手段结合起来,电化学检测,电化学发光检测,比色法,荧光检测以及质谱检测等等。但是现有的方法都存在各种各样的缺点,灵敏度不够,费时费力以及操作繁琐等。而对于信号扩增的方法来说,虽然现在已经有很多扩增的方法能够高灵敏度的检测蛋白,但它们都有着各种缺点,限制了它们的实际应用。比如,酶联免疫PCR技术和酶联免疫RCA技术(中文全称免疫滚环扩增)检测蛋白的灵敏度很高,但这两类技术都是基于抗体的,抗体的合成需要花费大量的时间和劳动力并且抗体容易变异。后来发展出了基于适配体的PCR和RCA技术,这些方法很好的克服了抗体带来的各种问题,并且也有很高的灵敏度和特异性。但凡是利用PCR作为检测手段的都无可避免的要应用温度循环并且在反应结束的时候要对产物进行常规分析。基于适配体的RCA就很好的解决了这些问题,RCA技术是在等温条件下进行的,但是能应用于RCA技术与靶蛋白结合使整个实验启动的探针的设计是很复杂。这些都限制了这些方法的广泛应用。还有一些基于纳米金以及Cds纳米粒子的扩增手段,灵敏度也很高,但探针和这些纳米粒子的标记需要花费大量的时间。所以,在蛋白检测领域,人们开始致力于发展高灵敏度的,易于操作和设计的,等温的并且能够快速检测的手段。
Nicking酶扩增方法是近些年发展起来的一种高灵敏度的检测方法。基于nicking酶的扩增方法具有很多优势,比如能在等温条件下扩增,可以得到较高的灵敏度,所用的探针设计原理简单等。利用nicking酶进行的扩增方式一般是通过扩增信号分子达到提高灵敏度。Nicking酶能够识别双链DNA分子但只切割其中的一条链。改变了传统的靶分子和信号分子一对一的关系,使得一个靶分子能使多个信号分子发挥作用,从而达到扩增信号的目的。
Nicking酶扩增方法已经被应用于DNA和RNA的检测并得到了较高的灵敏度。我们第一次提出将Nicking酶的扩增模式应用于蛋白的检测。传统的荧光法检测蛋白最多的方式是,一个目标蛋白导致一个分子信标荧光集团的发光,而本文利用了Nicking酶,使得一个目标蛋白可以导致很多荧光探针的打开,提高了反应的灵敏度。而对于不同的蛋白质或者其他被筛选出适配体的分子,只要更换其对应的适配体就可以达到高灵敏度的检测。