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研究背景：卵巢恶性肿瘤是女性生殖道最常见的肿瘤之一，因其早期症状不明显，往往诊断时已是III-IV期，死亡率居妇科肿瘤首位。尽管近年来随着手术技术的改进及一些新化疗药物的应用，卵巢癌的预后有了较大的改善，但5年存活率仍徘徊在30％左右，因此，寻求新的治疗方法成为当务之急。自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）是机体重要的免疫细胞，其不仅可应用于肿瘤的过继免疫治疗，还可作为辅助疗法，清除术后微小残留病灶、降低复发，并已在临床试验中取得疗效。糖类抗原CA125(carbonate antigen125，CA125)是20世纪80年代发现的一种肿瘤相关抗原。由于血清CA125对卵巢癌有一定的敏感性和特异性，因此目前CA125作为一种肿瘤标志物在上皮性卵巢癌的辅助诊断、严重程度的评估、疗效监测、提示复发和预后判断方面均有很好的价值。然而，随着对CA125蛋白生物学功能研究的深入，众多学者已不将CA125仅仅定义为一项肿瘤标志物，而更多关注于它的生物学功能的研究。目前国外已有部分实验证明，CA125能特异性结合NK细胞，并抑制它们的细胞溶解活性。因此，进一步的研究CA125与肿瘤细胞免疫之间的关系，探讨CA125对NK功能的影响将有利于改善以NK细胞为主的免疫治疗的效果，进而为治疗卵巢癌疾病寻找新的治疗靶点。本课题研究内容包括：（1）CA125对NK细胞功能的抑制作用；（2）CA125在体内对卵巢癌细胞致瘤性的影响；（3）上皮性卵巢癌患者免疫微环境及NK细胞功能状态的研究。目的：探讨CA125对NK细胞功能的抑制作用，并进一步对上皮性卵巢癌患者免疫微环境及NK细胞功能状态进行研究，为NK细胞用于卵巢癌的临床治疗提供理论依据。方法：1.体外实验：1)乳酸脱氢酶（LDH）法检测不同剂量CA125处理后的NK细胞对K562细胞的杀伤功能。2)应用流式细胞仪检测CA125处理后NK细胞表面活化性及抑制性受体的表达情况。3)采用流式细胞术检测CA125处理后NK细胞的凋亡变化。4)采用CellTiter96Aqueous检测CA125对卵巢癌细胞SKOV3增殖的影响。2.体内实验：1) PBS重悬人卵巢癌细胞SKOV3，将细胞调制浓度分别为1×107个/ml。2)取10只CD1nu/nu裸鼠，将已准备好的细胞悬液用1ml注射器经皮下注射到CD1nu/nu裸鼠左侧肩胛部皮下，100ul每只鼠。3)待肿瘤皮下可触及时，实验组5例裸鼠给予CA125腹腔注射(5×104U/kg)，对照组5例裸鼠给予溶剂处理。4)分别于成瘤后的第1、2、3、4、5周用游标卡尺测量肿瘤体积，按照公式：肿瘤体积=（长×宽2）/2计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。5)于5周末处死动物，并将肿瘤组织剥离称取肿瘤重量。3.临床资料分析：1)应用流式细胞仪及PCR方法分别检测上皮性卵巢癌患者外周血NK细胞、腹水NK细胞表面活化性和抑制性受体的表达情况。2)采用基于磁珠技术的流式细胞术（cytometric bead array，CBA）检测卵巢恶性肿瘤患者腹水中细胞因子含量。3)应用流式细胞仪检测在腹水中培养72h后的NK细胞表面活化性及抑制性受体的表达情况。结果：1.体外实验：1)乳酸脱氢酶（LDH）法测NK细胞杀伤功能，结果显示，在不同效靶比时，CA125均可抑制NK细胞对K562细胞的杀伤活性，且呈浓度依赖性。当效靶比为25:1时，各组的杀伤活性表现为CA12550KU/ml组﹤25KU/ml组﹤10KU/ml组﹤0.5KU/ml组﹤对照组，10KU/ml组和25KU/ml组所测杀伤率依次为（34.62±1.36）%、（33.62±1.74）%，显著低于对照组（51.28±2.61）%，差异具有统计学意义。当效靶比为10:1时，各组的杀伤活性亦随CA125浓度的升高而降低，10KU/ml组和25KU/ml组所测杀伤率依次为（33.33±1.76）%、（26.07±2.63）%，低于对照组（39.32±1.74）%，差异具有统计学意义。2) NK细胞表面受体流式细胞术检测结果显示，10KU/ml CA125处理NK细胞72h后，NK细胞表面CD16，CD94/NKG2A，NKG2D，Nkp44受体表达下调，与对照组相比较，差异有统计学意义（P﹤0.05），而CD226，Nkp30，Nkp46受体表达并未见明显差异。3)流式细胞术检测NK细胞凋亡结果显示，不同剂量CA125处理NK细胞72小时后不增加NK细胞凋亡。4) CellTiter96Aqueous细胞增殖实验结果示，CA125组与对照组之间并无明显差异，表明在体外，CA125对卵巢癌细胞SKOV3并无促增殖作用。2.体内实验：5周后CA125组小鼠的肿瘤体积及肿瘤质量均较对照组增大，差异有统计学意义（P﹤0.05）。3.临床资料分析：1)流式细胞术及PCR方法检测结果示，NK细胞表面活化性及抑制性受体在卵巢癌患者外周血及腹水NK细胞上的表达显著低于健康人外周血NK细胞（P﹤0.05）。卵巢癌患者PFNK各活化性受体基因的表达量较健康人明显降低。2) CBA检测结果示，5例上皮性卵巢癌患者腹水中Th1类因子IL-8、IL-12含量降低，Th2类因子IL-6、IL-10、TNF-a含量升高，上皮性卵巢癌患者腹水表现出Th2优势状态。3)应用流式细胞术检测在腹水中培养72h后的NK细胞表面受体结果示，CA125组NK细胞表面活化性及抑制性受体表达较对照组相比显著降低（P﹤0.05）。结论：CA125可以抑制NK细胞杀伤功能，呈时间和剂量依赖关系并且不影响细胞凋亡。CA125在体内可增强卵巢癌细胞的致瘤性，而其本身对卵巢肿瘤细胞的增殖并无促进作用。上皮性卵巢癌患者腹水中CA125水平明显升高且呈Th2优势状态，抑制了NK细胞功能。