骨质疏松症是一种以骨量减少,骨脆性增加为特点的疾病。骨的退变源于骨吸收过程大于骨形成过程,而反映在细胞层面则是破骨细胞及成骨细胞的功能失衡。这两种细胞分别来源于造血干细胞（HSC）及骨髓间充质干细胞（BMSC）,而后者又可进一步分化为软骨细胞、肌细胞及脂肪细胞。在骨微环境中,骨量的维持需要平衡调控HSC及BMSC,以及由二者分化而来的破骨细胞、成骨细胞及脂肪细胞。三种细胞之间具有复杂的调控网络,彼此的信号沟通对于骨重塑及骨稳态至关重要。单一调节某种细胞可能间接的影响到另外两种细胞的生成及功能,从而使骨重塑进入抑制状态。临床用于治疗骨质疏松症的药物主要通过抑制破骨细胞或刺激成骨细胞而发挥作用,针对BMSC的成脂分化及脂肪细胞功能的药物尚未上市。他汀类药物早已被发现具有抑制破骨、促进成骨及抑制成脂的功能。最新的研究进一步证实了部分他汀类药物可以降低骨质疏松症及骨质疏松性骨折的发生率。他汀类药物可以抑制甲羟戊酸代谢途径中的限速酶（HMG-Co A还原酶）,因而在临床上通常被用于降低高脂血症或心血管疾病患者的胆固醇水平。脂溶性的辛伐他汀已被证明具有治疗骨质疏松症的潜力。该药物主要通过刺激成骨细胞生成和抑制成骨细胞凋亡而发挥促进骨形成的能力,并通过抑制破骨细胞分化及功能而对抗骨吸收。另外,辛伐他汀还具有抑制BMSC成脂分化的能力,从而直接或间接的通过多种机制促进成骨及抑制破骨过程,从而达到恢复骨量的目的。目前对于其调控破骨细胞和成骨细胞的作用机制已比较清晰,但其抑制BMSC成脂分化的机制却研究较少,有必要进行进一步的探索。chemerin是成熟脂肪细胞分泌的脂肪因子,在BMSC成脂分化过程中起着至关重要的作用。其生物学功能的发挥依赖于与细胞膜上CMKLR1、GPR1和CCRL2三种受体的结合。2018年,“国际基础和药理学联合会命名和药物分类委员会”分别将CMKLR1和GPR1重新命名为chemerin受体1和chemerin受体2。在动物水平的研究证明了chemerin信号通路与骨质疏松症的发生具有相关性,而体外研究则进一步揭示了该通路与成脂分化的关系。另外,现已发现chemerin/CMKLR1信号通路可以负向调控BMSC向成骨细胞分化,并促进HSC向破骨细胞分化,这进一步说明了其在骨稳态调控过程中的作用。CMKLR1与GPR1在序列及结构上高度相似,在代谢性疾病及心血管疾病中也有着类似的功能,但很少有学者将GPR1受体与骨代谢联系起来。由于chemerin信号通路所调控的脂肪细胞、成骨细胞及破骨细胞与他汀类药物的作用对象高度一致,并且该信号通路促进成脂、抑制成骨及促进破骨的生物学作用与他汀类药物对相同过程的效应截然相反,因此chemerin信号通路可能介导了辛伐他汀抑制BMSC成脂分化的过程。本研究检测了辛伐他汀对BMSC成脂分化的作用及对chemerin信号通路表达的影响,并通过腺病毒干扰的方法研究CMKLR1在辛伐他汀的成脂抑制效应中的作用。在此基础上,还利用PPARγ激动剂罗格列酮进行挽救实验,探究辛伐他汀抑制BMSC成脂分化的机制。第一章大鼠原代BMSC的鉴定及辛伐他汀浓度的筛选目的:提取SD大鼠原代BMSC,并进行传代、纯化及鉴定,为后续以BMSC为基础的研究提供充足、可靠的细胞来源。分析辛伐他汀最佳干预浓度,从而在此基础上进行后续的机制研究。方法:1.实验动物:10只4周龄雌性SPF级SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,体重约80g。2.大鼠原代BMSC的提取:脱颈法处死大鼠,消毒后,无菌环境中暴露双侧髋关节至踝关节部分骨骼。游离双侧胫骨和股骨,紫外照射后,清除骨骼上残留的肌肉及韧带组织。剪断股骨和胫骨两侧骨骺端,注射器抽取5ml提前配置好的BMSC基础培养基,插入长骨的一端,快速将骨髓腔内容物冲洗干净。1200r/min离心5min后弃去上清液,用BMSC基础培养基重悬细胞,接种于培养瓶中继续培养。3.大鼠BMSC的传代及纯化:大鼠原代BMSC提取后48h半量换液,其后每3d全量换液。瓶底贴壁细胞达到80%融合度时,经胰酶消化及培养基终止消化,将瓶内含有细胞的培养液移入离心管,1200r/min离心5min。弃去上清液,用BMSC基础培养基重悬细胞,按1:3-1:5的比例进行传代。4.流式细胞术检测BMSC表面分子标志物:取传代至P3的BMSC,调整细胞浓度为1×106/100μl。于EP管中依次加入小鼠抗大鼠CD44、CD90、CD11b、CD45抗体,吹打混匀后置于4℃避光孵育30min。PBS洗涤后,向EP管中加入对应的FITC、PE、APC标记二抗,4℃避光孵育30min。再次PBS洗涤,并用PBS溶液补足EP管中体积至500μl。尽快流式细胞仪检测。5.大鼠BMSC的成脂分化方案及鉴定:取传代至P3的BMSC,以1×105/ml浓度种板,至融合度达90%-100%时,将BMSC基础培养基更换为BMSC成脂诱导培养基A液,3d后换为BMSC成脂诱导培养基B液,1d后再次换为A液。持续3-4轮循环后改为单纯B液维持培养,每3d换液。至分化2-3周后通过油红O染色鉴定BMSC的成脂分化能力,染色后光镜下观察成脂效果。6.大鼠BMSC的成骨分化方案及鉴定:取传代至P3的BMSC,以1×105/ml浓度种板,至融合度达80%-90%时,将BMSC基础培养基更换为等量的BMSC成骨诱导培养基,每3d换液。至分化3-4周后通过茜素红染色鉴定BMSC的成骨分化能力,染色后光镜下观察成骨效果。7.CCK-8法检测不同药物浓度对BMSC增殖的影响:将BMSC以1×104/ml浓度种于96孔板,3d时更换培养基。向每孔中加入终浓度分别为10-5M、10-6M、10-7M及10-8M的辛伐他汀,并以不含细胞的BMSC基础培养基为对照。分别于加药后1d、2d、3d、4d和5d向孔内加入10μl CCK-8溶液,孵育1h后,酶标仪检测450nm的吸光度。8.所有实验结果均以均数±标准差（mean±SD）表示。辛伐他汀浓度的筛选中,采用单因素方差分析（ANOVA）进行不同组间差异的比较。通过SPSS 22.0进行数据分析。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.BMSC传代过程中的细胞形态学观察:提取的原代BMSC镜下为大小不一的混杂细胞。经多次换液,未贴壁的悬浮细胞及贴壁的小圆形细胞逐渐减少,而贴壁的丝状细胞逐渐增多,呈放射状生长,并逐渐变为梭形,出现多个旋涡状生长中心。2.BMSC表面抗原的鉴定:传代至P3的BMSC细胞表面CD90和CD44表达率分别为95.23%和95.21%,而CD45和CD11b表达率分别为1.15%和0.27%,符合鉴定BMSC的表面标记的标准。3.BMSC成脂诱导分化的鉴定:BMSC成脂分化过程中,细胞逐渐由梭形变为多边形,胞内出现小泡状结构,内含清亮的淡黄色液体。随着成脂分化的进行,小泡状结构逐渐融合为大而圆的泡状结构。于分化后2-3周进行油红O染色,可见胞内泡状结构被染为红色,说明泡状结构内为脂滴。4.BMSC成骨诱导分化的鉴定:BMSC成骨分化过程中,细胞逐渐由梭形变为多角形,胞内出现逐渐增多的砂样沉积物,细胞之间也可见到不规则砂样沉积。细胞内外沉积物逐渐融合,细胞失去原有结构。于成骨分化4周左右进行茜素红染色,可见砂样沉积区域被染为红色,说明含有大量的钙组织。5.不同浓度辛伐他汀干预对BMSC增殖的影响:加入不同浓度辛伐他汀后5d内,高浓度他汀（10-5M和10-6M）干预的细胞组的增殖率显著降低,与对照组相比具有统计学差异。低浓度他汀（10-8M）干预的细胞组较对照组增殖率略微升高,差异具有统计学意义。10-7M他汀干预的细胞组增殖率与对照组无统计学差异。因此,在检测周期内,10-7M辛伐他汀组对BMSC增殖的影响最小。结论:通过贴壁法纯化获得的SD大鼠BMSC,可用于后续以其为基础的辛伐他汀抑制成脂分化的机制研究。第二章辛伐他汀抑制BMSC成脂分化与chemerin信号通路表达的相关性研究目的:检测BMSC成脂分化过程中PPARγ和chemerin信号通路在辛伐他汀干预下的表达,初步探究二者在辛伐他汀抑制BMSC成脂分化过程中的作用。方法:1.实验细胞:选取传代至P3的BMSC进行相关实验。2.辛伐他汀干预方案的筛选:设置SIM组在成脂分化全程中加入终浓度为10-7M的辛伐他汀;A组在成脂分化前3d加入终浓度为10-7M的辛伐他汀,3d后加入等量的PBS溶液;B组在成脂分化3d后加入终浓度为10-7M的辛伐他汀,3d内加入等量PBS溶液;CON组在成脂分化全程中加入等量PBS溶液。于成脂分化14d检测各组细胞胞内脂滴形成情况及脂肪细胞标志基因在蛋白水平的表达。3.辛伐他汀干预通路基因表达的实验方案:设置SIM组及CON组分别于每次更换成脂诱导培养基时分别加入终浓度为10-7M的辛伐他汀及等量的PBS溶液。于成脂分化第3d、7d和14d收集细胞样本,检测PPARγ、chemerin、CMKLR1和GPR1基因在m RNA水平的表达。4.Western Blot法检测adiponectin表达:于成脂分化14d收集细胞样本,通过BCA法测定提取的胞内蛋白浓度。配制10%分离胶和5%浓缩胶,进行SDSPAGE电泳,随后进行半干式转膜。经奶粉封闭、一抗孵育（adiponectin,1:1000;β-tubulin,1:1000）及二抗孵育后,将PVDF膜进行显色反应,通过软件分析曝光程度。5.q RT-PCR法检测PPARγ、chemerin、CMKLR1、GPR1及adiponectin表达:于成脂分化3d、7d和14d时收集细胞样本并提取RNA,通过紫外分光光度计检测提纯后的RNA浓度。设置GAPDH为内参基因,经逆转录反应（37℃,15min;85℃,5sec）合成c DNA后,通过两步法进行荧光定量反应（95℃,5sec;60℃,30sec;40循环）,通过2?ΔΔCT法计算m RNA表达水平。6.所有实验结果均以均数±标准差（mean±SD）表示。辛伐他汀干预方案的筛选中,采用单因素方差分析（ANOVA）进行不同组间差异的比较。辛伐他汀对通路基因表达影响的实验则采用配对t检验分析组间差异。通过SPSS 22.0进行数据分析。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.不同辛伐他汀干预方案对BMSC成脂分化程度的影响:BMSC成脂分化后14d,油红O染色显示,实验全程辛伐他汀干预的BMSC胞内脂滴最少,而全程使用PBS干预的对照组脂滴最多。只在前3d应用辛伐他汀的实验组BMSC胞内脂滴有低等程度的融合,但整体上脂滴数量不多。成脂分化3d后使用辛伐他汀的细胞脂滴数量则介于全程应用及3d前应用他汀的实验组之间。成脂分化14d时,Western Blot显示出与脂滴数量相对应的adiponectin表达。因此,辛伐他汀在BMSC成脂分化的全过程中均起到了抑制脂滴形成的作用。2.辛伐他汀干预对BMSC成脂分化过程中PPARγ和chemerin表达的影响:q RT-PCR结果显示,辛伐他汀干预不影响PPARγ和chemerin表达升高的趋势。3d时,辛伐他汀干预组与对照组的PPARγ和chemerin表达水平并无显著区别。7d和14d时,对照组表达显著高于辛伐他汀干预组,结果具有统计学差异。因此,辛伐他汀在BMSC成脂分化过程中抑制PPARγ和chemerin表达。3.辛伐他汀干预对BMSC成脂分化过程中CMKLR1和GPR1表达的影响:q RT-PCR结果显示,辛伐他汀干预不影响CMKLR1和GPR1表达降低的趋势。3d时,辛伐他汀干预组与对照组的CMKLR1和GPR1表达水平并无显著区别。7d和14d时,对照组表达显著低于辛伐他汀干预组,结果具有统计学差异。因此,辛伐他汀在BMSC成脂分化过程中促进CMKLR1和GPR1表达。4.辛伐他汀干预对BMSC成脂分化过程中adiponectin表达的影响:q RTPCR结果显示,辛伐他汀干预不影响adiponectin表达升高的趋势。3d和7d时,辛伐他汀干预组与对照组的adiponectin表达水平并无显著区别。14d时,对照组表达显著高于辛伐他汀干预组,结果具有统计学差异。因此,辛伐他汀在BMSC成脂分化过程中抑制adiponectin表达。结论:辛伐他汀可能通过下调PPARγ和chemerin信号通路而实现其对成脂分化的抑制作用。第三章CMKLR1及PPARγ在辛伐他汀抑制BMSC成脂分化过程中作用的研究目的:检测CMKLR1缺失时辛伐他汀干预对BMSC成脂分化及chemerin信号通路表达的影响,探究chemerin受体在辛伐他汀抑制BMSC成脂分化过程中的作用。通过罗格列酮挽救实验进一步探索PPARγ能否作为chemerin信号通路的上游信号而参与辛伐他汀抑制BMSC成脂分化的过程。方法:1.实验细胞及质粒:病毒包装选取的293A细胞、病毒滴度检测所用293T细胞购自中国科学院细胞库。重组穿梭质粒和包装质粒购自吉玛公司。通路研究所用细胞选取传代至P3的BMSC。2.腺病毒包装、扩增及纯化:向293A细胞培养基中逐滴加入提前混合好的含目标序列为GCAATGGCCTGGTGATTGTCA的穿梭质粒、骨架质粒、不含血清及双抗的DMEM及RNAi-Mate。继续培养6h后,换为含10%FBS的DMEM培养基。细胞与腺病毒混合液共同孵育14d,期间分别于3d、7d和10d补充培养基。收集细胞后进行反复融冻,获得病毒裂解原液,并以原液在293A细胞中进行病毒扩增。联合应用Cs Cl密度-梯度离心和透析法纯化扩增后的病毒液,收集纯化后的病毒。3.腺病毒滴度测定:将293T细胞按1×104/孔种于96孔板,加入用含10%FBS的DMEM培养基稀释102、103、104、105、106、107倍的待测纯化病毒液。接种腺病毒72h后,光镜下观察各组细胞病变效应。并通过公式计算出纯化后的病毒滴度。4.确定最佳感染复数（MOI）及病毒侵染效率的验证:将BMSC以3×103/孔接种于96孔板,根据是否添加5 ug/ml聚凝胺而分为两组,同时分别设置1:10、1:100和1:1000的梯度MOI亚组。向各组中加入按以上比例稀释的病毒液,24h后更换为BMSC基础培养基。72h和96h后,荧光显微镜下观察GFP荧光表达。用MOI为100稀释的病毒液及终浓度为5 ug/ml的聚凝胺孵育传代至P3的BMSC,24h后更换为100μl含10%FBS的α-MEM培养基。72h和96h后,通过q RT-PCR和Western Blot法检测BMSC中CMKLR1（NM₀08153）在m RNA和蛋白水平的表达情况。5.病毒侵染BMSC的实验分组:BMSC成脂分化过程中,设置SIM组及CON组为每次更换培养基时分别加入终浓度为10-7M的辛伐他汀及PBS溶液。各组内,分别用BLANK、NC和CKD代表PBS干预、病毒阴性对照干预及CMKLR1敲低干预后的实验分组,并于成脂分化前48h进行病毒侵染,分化前24h换为含10%FBS的α-MEM培养基。于成脂分化3d和14d检测chemerin、CMKLR1、GPR1和adiponectin在m RNA水平的表达。6.油红O染色定量分析:分组同病毒侵染实验。以前述方案对成脂分化后的BMSC进行油红O染色。染色后用PBS清洗,并通过异丙醇溶液提取染料,于490nm波长下检测溶液吸光度。7.罗格列酮挽救实验:分别设置对照组（CON）、罗格列酮干预组（ROSI）、罗格列酮及辛伐他汀干预组（ROSI+SIM）及辛伐他汀干预组（SIM）。罗格列酮干预组全程添加0.5μM罗格列酮溶液,罗格列酮和辛伐他汀干预组则按前述方案添加两种试剂。8.统计方法:所有实验结果均以均数±标准差（mean±SD）表示。采用单因素方差分析（ANOVA）进行不同组间差异的比较。通过SPSS 22.0进行数据分析。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.不同MOI下腺病毒的侵染效率:病毒侵染后96h后,1:10、1:100和1:1000三个稀释比例的病毒侵染组均出现不同程度的GFP绿色荧光,但1:100时荧光最多。说明以该稀释浓度的病毒兼顾了侵染细胞数量及病毒毒性的影响,具有最佳的侵染效果。2.病毒侵染BMSC后的荧光复检及腺病毒的侵染效率验证:空白对照组、病毒阴性对照组和CMKLR1敲低组BMSC的荧光检测显示,腺病毒及其阴性对照病毒均可成功侵染BMSC。q RT-PCR和Western Blot结果显示腺病毒的干扰效率约为正常水平的20%-25%,可有效降低CMKLR1表达。3.CMKLR1敲低时辛伐他汀干预对CMKLR1表达的影响:成脂分化后3d和14d的q RT-PCR结果显示,在CMKLR1敲低（CKD）时,对照组（CON）和辛伐他汀干预组（SIM）都出现了显著降低的CMKLR1表达水平,且辛伐他汀无法发挥原本14d时升高CMKLR1表达的作用。因此,腺病毒侵染所导致的CMKLR1表达降低并不依赖于辛伐他汀对成脂的抑制作用。4.CMKLR1敲低时辛伐他汀干预对脂肪细胞标志基因adiponectin表达的影响:成脂分化后3d和14d的q RT-PCR结果显示,对照组（CON）和持续应用辛伐他汀干预组（SIM）内,CMKLR1敲低（CKD）均出现显著降低的adiponectin表达,说明在CMKLR1敲低的情况下,BMSC难以向成熟脂肪细胞分化,而CMKLR1敲低所导致的成脂抑制效应并不依赖于是否应用辛伐他汀。辛伐他汀可于分化后14d降低adiponectin表达,但CMKLR1敲低时,辛伐他汀干预组和对照组中adiponectin表达却并无差异。因此,辛伐他汀抑制BMSC成脂分化依赖于功能正常的CMKLR1。5.CMKLR1敲低时辛伐他汀干预对GPR1表达的影响:成脂分化后3d和14d的q RT-PCR结果显示,在CMKLR1敲低（CKD）时,对照组（CON）和辛伐他汀干预组（SIM）都出现了显著降低的GPR1表达水平。CMKLR1敲低时GPR1表达下降,说明在CMKLR1缺失的情况下,GPR1并未发挥代偿CMKLR1的作用。此时,辛伐他汀也无法发挥其14d时促进GPR1表达的作用。因此,在CMKLR1敲低时,辛伐他汀无法影响成脂分化及chemerin信号通路表达。6.CMKLR1敲低时辛伐他汀干预对BMSC油红O染色的影响:成脂分化2-3w后油红O染色结果显示,CMKLR1敲低（CKD）时,无论对照组（CON）还是辛伐他汀干预组（SIM）都无法形成大而饱满的脂滴。肉眼观察及对染料的定量分析都显示出成脂效果远低于未敲低（BLANK）及病毒空转组（NC）,阻滞chemerin-CMKLR1信号通路可以很大程度上阻断BMSC的成脂分化过程。辛伐他汀干预并不能进一步降低油红O的染色程度,因此,辛伐他汀对BMSC的成脂抑制效应依赖于chemerin-CMKLR1信号通路。7.罗格列酮挽救实验:成脂分化后3d及14d,罗格列酮显著上调了PPARγ和chemerin表达,辛伐他汀干预（SIM）下调的PPARγ和chemerin表达也可被罗格列酮所部分挽救（ROSI+SIM）,而CMKLR1及GPR1表达则在罗格列酮的作用下有所降低。成脂分化后14d,与对照组相比（CON）,罗格列酮干预后的BMSC显示出更高的adiponectin表达。以上结果综合说明,辛伐他汀通过抑制PPARγ介导的chemerin信号通路而抑制BMSC成脂分化,通过罗格列酮激活PPARγ信号可部分挽救辛伐他汀的成脂抑制效应。结论:下调PPARγ-chemerin-CMKLR1信号通路可能是辛伐他汀抑制BMSC成脂分化的机制之一。