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干旱是导致小麦减产的主要非生物胁迫之一,全球每年约30%的小麦受到干旱的威胁。除此之外,缺氮在干旱地区也是限制小麦生产的另外一个重要非生物胁迫。迄今为止,对植物抵抗非生物胁迫的研究主要集中在单一抗性如干旱或者低氮等,尚未发现具有抗旱、耐低氮协同改良功能的基因。同时,关于抗旱性或耐低氮基因功能的研究大多在温室条件下完成,田间条件下的多年多点育种利用价值评价研究很少。本研究将来自大豆的两个DREB(drought response element binding factor)类转录因子基因GmDREB1及GmDREB3,分别导入我国大面积推广小麦品种济麦19、济麦20、石4185和济麦22,创制转基因小麦新品系。通过室内和田间多年多点抗旱性耐低氮性鉴定,评价转GmDREB1/3基因小麦抗旱性,分析GmDREB3转基因小麦耐低氮特性,同时进一步分析了转基因小麦抗旱和耐低氮特性的作用机制。取得的主要结果如下:1.转基因小麦抗旱性鉴定:室内干旱处理条件下,转GmDREB1/3基因小麦苗期存活率显著高于野生型(WT),离体叶片失水率均低于WT。多年多点田间抗旱鉴定结果显示,限水处理条件下,GmDREB1转基因小麦三年三点平均产量比WT增产4.79-18.43%;GmDREB3转基因小麦三年三点平均产量比WT增产5.30-13.96%(P<0.05)。在不浇水条件下,转GmDREB3基因小麦三年平均产量比WT增产7.70-11.39%(P<0.05)。在正常灌溉条件下,转基因小麦比WT稍增产或平产。产量三要素分析结果表明,转GmDREB1/3基因小麦产量增加主要来自于亩穗数显著增加,其它农艺性状与WT相似。四种抗旱评价指数SSI,TOL,STI和“b”分析结果表明,转GmDREB1/3基因小麦抗旱性显著高于WT,不同转基因株系间存在差异。水分利用效率分析结果显示:转GmDREB1/3基因小麦水分利用效率平均比WT分别提高了20%和10%。2.GmDREB1转基因小麦抗旱生理机制分析:在干旱胁迫下,转基因小麦叶片相对电导率(REL)和丙二醛(MDA)含量降低,叶片含水量、脯氨酸含量、叶绿素含量、光合效率和可溶性蛋白含量,谷氨酰胺合成酶(GS)活性和rubisco大亚基稳定性均显著高于WT。根系形态学观察发现,转基因小麦在干旱处理下,苗期的根鲜重和干重明显高于WT,还发现平均根直径和中柱鞘直径显著比WT增加;相比于WT,转基因小麦深层根系发达,根系活力更强。3.GmDREB1转基因小麦分子机制分析:转录组分析结果显示,干旱胁迫下转基因小麦与WT相比,上调表达的基因主要涉及刺激响应及信号传导两类。其中,多个下游基因与激素褪黑素合成相关,包括COMT(caffeic acid O-methyltransferase),TDC(tryptophan decarboxylase)和SNAT(serotonin N-acetyltransferase)。QPCR 分析证明这三个基因在转基因小麦根及叶片中均上调表达,这一结果与干旱胁迫下转基因植株叶片和根系中褪黑激素含量提高结果一致。同时,外施褪黑素显著增加PEG模拟干旱胁迫下转基因小麦株高、根长和生物量。DREB类转录因子通过调控褪黑素合成影响植物抗旱性可能是一种新的植物缺水胁迫响应机制。此外,多个下游基因与植物光合作用相关,例如光合作用相关基因WHAB1.6在转基因小麦中上调表达,这一结果与转GmDREB1基因小麦高光合作用的表型一致。这些结果说明,GmDREB1通过调控褪黑素合成以及光合作用相关基因的表达提高转基因小麦抗旱性。4.GmDREB3转基因小麦抗旱生理机制分析:旱棚限水条件下,在小麦三个主要生育期(拔节期、开花期和灌浆期),转基因小麦降低了 REL和MDA含量,增加了脯氨酸和叶绿素含量,提高了抗氧化胁迫相关酶POD活性。在田间限水条件下,转基因小麦开花后旗叶和倒二叶的光合能力明显高于WT,渗透调节能力增强(脯氨酸和可溶性糖含量增加),MDA在含量降低,抗氧化系统酶活性增强(SOD、POD和CAT)。田间和旱棚限水条件下的抗旱性鉴定结果表明,GmDREB3通过提高转基因小麦光合能力和抗氧化系统活性,增强了转基因小麦的抗旱性。5.GmDREB3转基因小麦耐低氮鉴定:室内低氮胁迫试验结果证明,转基因小麦幼苗在低氮处理后,株高、生物量、地下部根长、根量等性状显著好于WT,地上部含氮量也显著高于WT。在正常生长条件下,转GmDREB3基因小麦和WT之间无明显差异。根部NO3-动态变化测定结果发现,转基因小麦根系在低硝酸盐处理下一直保持内吸NO3-,而WT变化不明显。在田间成熟期,转GmDREB3基因小麦的根系和籽粒中氮浓度比WT分别提高10.00-40.20%和16.20-36.00%。连续两年田间试验结果显示,在低氮胁迫条件下,与WT相比转基因小麦叶功能持续时间长,光合作用显著增强,两年平均产量比WT增产6.33-22.53%(P<0.05),产量增加的原因主要来自于亩穗数增加。6.GmDREB3协同改良转基因小麦抗旱性和耐低氮性分子机制解析:染色体免疫共沉淀(ChIP-seq)结果显示,GmDREB3特异性结合许多氮和抗逆相关基因启动子并激活其表达,包括:硝酸盐转运体NRT2.5、LEA、EREBP1、WRKY46等。另一个参与独脚金内酯途径的基因TB1在转基因小麦中下调表达,可能与GmDREB3转基因小麦每平米穗数增加的表型相关。QPCR和LUC实验证明,GmDREB3在体内特异的结合LEA和NRT2.5基因启动子DRE元件证明这二个基因是GmDREB3的下游靶基因。总之,室内及田间多年多点实验结果证明,GmDREB1/3能够显著提高转基因小麦抗旱性,同时,GmDREB3基因还可以提高转基因小麦耐低氮胁迫的能力。通过生理指标测定及转录组分析,解析了GmDREB1/3提高转基因小麦抗逆性的作用机制。这些研究结果为利用GmDREB1/3开展作物分子育种提供理论基础,也为协同提高作物抗旱及耐低氮胁迫能力研究提供了新的思路。