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全基因组关联研究显示,肥胖基因FTO(Fat mass and obesity associated)的单核苷酸多态性位点不仅与肥胖相关,还与其它代谢疾病和癌症相关。FTO基因敲除和过表达小鼠模型以及细胞水平上的研究,表明了FTO基因的表达或功能改变能够引发机体能量代谢和白色脂肪组织积累的异常。体外生化实验证实FTO对单链RNA或单链DNA上的3-甲基尿嘧啶(3meU)或3-甲基胸腺嘧啶(3meT)具有去甲基化活性。然而,FTO调控能量代谢和肥胖发生的分子机制还尚不清楚。 本博士论文重点研究FTO的体内作用底物类型,及其调控白色脂肪细胞分化的潜在分子机制。 通过体外高效液相色谱和质谱系统检测,发现FTO能够去甲基化核酸上的6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰。这种去甲基化反应具有加双氧酶的特性,需要共作用因子二价铁离子和α-铜戊二酸。通过从293T细胞和HeLa细胞中提取mRNA以检测m6A水平,发现FTO表达缺失的细胞中m6A水平升高;相反,FTO过表达的细胞中,m6A水平降低。m6A可能与mRNA剪切、运输等加工过程相关。上述发现表明,m6A可能作为新的RNA表观调控手段参与基因的表达调控。FTO定位在细胞核中剪切因子仓库speckle亚细胞器中,暗示着FTO可能参与到RNA的剪切加工调节。在哺乳动物细胞中,m6A修饰是mRNA上的主要修饰之一。本研究首次发现m6A去甲基化酶FTO,证明m6A是一种具有类似于DNA甲基化的基因表达调控功能的表观修饰拓展和丰富了以m6A表观修饰为核心的表观转录组学新研究领域。 在取得上述发现的基础上,进一步用白色脂肪前体细胞3T3-L1作为细胞模型,初步探索了FTO对脂肪细胞分化的调控机制。与FTO基因敲除小鼠的表型一致,FTO基因敲低后的3T3-L1细胞分化和脂肪生成受到抑制。在脂肪细胞分化过程中FTO的表达水平呈下降趋势,而mRNA上m6A修饰水平上升,这暗示着FTO调控的m6A修饰在脂肪细胞分化和脂肪生成过程中起着重要的生理作用。因此,找到脂肪细胞中受FTO调控的下游靶基因成为了解决问题的关键。结合转录组测序技术、含m6A的mRNA免疫沉淀技术(MeRIP-Seq)和光活性增强的核糖核苷酸交联和免疫共沉淀技术(PAR-CLIP),对该问题进行初步探索。转录组结果显示,FTO基因敲低的3T3-L1细胞中转录相关和代谢相关的功能通路受到显著扰动。其中参与脂肪细胞分化的关键因子,如REV-ERBα、PGC-1α、C/EBP-6、SREBP-2等,表达改变,不利于脂肪细胞正常分化。基于转录组数据进行的可变剪切分析,发现并验证了转录相关因子RUNX1T1、PBX2、ATF7和代谢相关因子HK2、DLAT1、PGLS发生可变剪切变化。同时,MeRIP结果显示RUNX1T1发生剪切变化的第6号外显子上有m6A修饰,并且PAR-CLIP结果验证了FTO能够结合到该外显子上。那么,FTO表达异常可能影响到这类重要因子的外显子上m6A水平,进一步影响了相关基因的可变剪切形式,最终影响了脂肪细胞的分化。 综上所述,FTO体内核酸作用底物的发现为RNA甲基化修饰作为表观转录组学新概念和新研究领域提供了重要依据。对脂肪细胞中FTO潜在作用底物的探寻,为阐明后续FTO调控脂肪生成和肥胖发生提供了新的线索。