目的脑出血是神经系统常见病、多发病,其致残率和死亡率均很高,严重影响人类的健康和患者的生存质量。本研究利用立体定向技术向大鼠尾状核内注入50μL自体股动脉血建立脑出血模型,用脑水含量和伊文思兰染色检测BBB的通透性,HE染色观察神经损伤,通过免疫组化法检测TNF-α、NF-κB、Caspase-3表达阳性细胞在大鼠脑出血后不同时间点表达变化规律和细胞分布。该实验研究表明,细胞凋亡机制不仅参与了脑出血继发性脑损伤,而且作用时间长,损伤范围也较广。试验证明血肿近缘以坏死为主,血肿周围主要以凋亡为主,远隔部位无凋亡发生,证明了脑出血后血肿周围神经细胞损伤有凋亡机制参与。有研究发现TNF-a表达量与细胞凋亡二者NF-κB、Caspase-3呈正相关；认为TNF-a的表达是细胞凋亡触发机制之一。本试验研究旨在研究TNF-α、NF-κB和Caspase-3是否在脑出血后血肿周围组织表达及细胞分布以及NF-κB和Caspase-3的相互关系。材料与方法一、材料1、动物分组：选择健康雄性SD大鼠100只,体重250-300g,随机分成4组：正常对照组、假手术组、生理盐水对照组、脑出血实验组,生理盐水对照组和脑出血实验组又分别按6h、1d、3d、7d分为4个亚组,每个亚组n=10。2、主要仪器：动物头颅立体定位仪、电子分析天平、图像分析仪、紫外分光光度仪、微量进样器、高温干燥箱。3、主要试剂：NF-κB兔抗鼠多克隆抗体、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体、TNF-α兔抗鼠多克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB试剂盒、伊文思兰、甲酰胺。4、大鼠脑出血模型制作：用微量注射器抽取70uL大鼠自体股动脉血。立即将大鼠俯卧位于脑立体定位仪上,于前囟前0.2mm,中线右旁3.0mm,进针约6mm(大鼠尾状核处),将大鼠白体股动脉血50uL缓慢推注入脑。生理盐水对照组注入50uL生理盐水。假手术对照组进行手术,但不进行注射。正常对照组不予任何处置。5、标本制作：(1)每组取5只大鼠于术后相应时间点麻醉开胸,迅速暴露心脏,4%多聚甲醛灌注固定,取脑,样本置于4%多聚甲醛外固定4小时,酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋。连续冠状切片,片厚5um,进行切片HE染色和免疫组化染色。(2)每组取5只大鼠于术后相应时间点,断头取脑后进行脑组织水含量和脑组织Evens Blue含量测定。二、检测指标1、脑组织水含量测定：于相应时间点将大鼠麻醉后断头处死,取出出血侧针孔前部脑组织,测湿重后,脑组织放入烤箱内烘干24小时后重复测定至恒重。按公式脑组织含水量(%)=(湿重-干重)／湿重×100%。以脑组织水含量代表脑水肿的程度。2、BBB通透性测定：取大鼠出血侧针孔后侧水肿区脑组织,按Belayev法使用伊文思兰(Evens blue,EB)测定BBB通透性。用EB含量(OD／mg)表示BBB通透性。3.NF-κB表达免疫组化测定：SABC法进行NF-κB蛋白、Caspase-3蛋白表达阳性的细胞测定。切片滴加50uL一抗工作液兔抗鼠多克隆NF-κB抗体(1：400),4℃过夜；然后滴加物素化山羊抗兔IgG,37℃20min；滴加SABC,37℃20min,各步骤用PBS洗3 min×3次；DAB显色剂,苏木素轻度复染,脱水透明,封片。显微图像分析系统采集图像,分析阳性细胞积分光密度。4.Caspase-3表达免疫组化测定：SABC法进行Caspase-3蛋白表达阳性的细胞测定。切片滴加50uL一抗工作液兔抗鼠多克隆Caspase-3抗体(1：150),4℃过夜；然后滴加物素化山羊抗兔IgG,37℃20min；滴加SABC,37℃20min,各步骤用PBS洗3 min×3次；DAB显色剂,苏木素轻度复染,脱水透明,封片。显微图像分析系统采集图像,分析阳性细胞积分光密度。5.TNF-α表达免疫组化测定：SABC法进行TNF-α蛋白表达阳性的细胞测定。切片滴加50uL一抗工作液兔抗鼠多克隆TNF-a抗体(1：200),4℃过夜；然后滴加物素化山羊抗兔IgG,37℃20min；滴加SABC,37℃20min,各步骤用PBS洗3 min×3次；DAB显色剂,苏木素轻度复染,脱水透明,封片。显微图像分析系统采集图像,分析阳性细胞积分光密度。三、统计分析所有数据以均数±标准差(x+SD)表示,采用SPSS16.0及Excel统计软件进行数据处理,组间比较用单因素方差分析(ANOVA),在单因素方差分析有意义的基础上再进行组间两两比较,两变量之间相关关系行Spearman相关分析,P<0.05为差异显著。结果1、脑水含量测定：大鼠实验性ICH后脑组织水含量于6h开始升高,3d达到高峰,7d时逐渐减少,但较对照组仍有显著差异(P<0.05)。2、脑组织EB含量测定：大鼠实验性ICH后脑组织EB的含量增加,6h即明显升高,3d达到最高,7d逐渐降低,但是与对照组相比仍有显著差异(P<0.05)。3、脑出血后Caspase-3蛋白表达：大鼠实验性ICH后6h在血肿周围和同侧大脑皮层有Caspase-3弱阳性表达,阳性部位主要为胞浆。1d出现大量阳性反应神经元。脑出血后3d达高峰,着色最深,呈棕褐色,并出现核阳性着色,说明Caspase-3裂解后有核转移。7d时数量减少,但积分光密度较对照组仍有显著差异(P<0.05)。4、脑出血后NF-κB表达：大鼠实验性ICH后血肿周围NF-κB阳性细胞于术后6h开始增多,1d表达继续上升,3d达高峰,此后NF-κB表达开始下降,持续到7d仍高于对照组(P<0.05)。其表达以胶质细胞为主,也有部分神经元细胞表达。阳性表达为胞核黄褐色,苏木素不能复染。血肿对侧也有少量NF-κB表达。假手术对照组和生理盐水对照组仅有极少量阳性细胞表达。5、脑出血后TNF-α的表达：大鼠实验性ICH后6h血肿周边组织TNF-a开始表达,3d达高峰,各组与对照组之间有著差异(P<0.05)。实验结果显示,血肿周围脑组织中免疫组化阳性细胞数增加,呈动态变化趋势,与光学显微镜下观察到的神经细胞水肿和周围间质组织水肿、炎性细胞浸润动态变化趋势相一致。讨论在本实验中采用向大鼠右侧尾状核内注射自体股动脉血制作脑出血模型,通过免疫组化法对NF-κB、Caspase-3 TNF-α进行检测,发现出血后的大鼠脑组织中NF-κB、Caspase-3、TNF-α均动态表达。近年来,许多实验研究都证实,细胞凋亡机制参与了脑出血后继发性损伤。在本实验中应用相邻切片分别进行Caspase-3、TNF-α和NF-κB的免疫组化染色,两者阳性细胞范围及时间变化基本一致。提示Caspase-3在脑出血后神经细胞凋亡途径中起重要调控作用。NF-κB信号通路是胞内信号转导通路中最重要的下游通路,参与炎症反应和细胞凋亡等重要的病理生理过程。本实验发现,NF-κB、Caspase-3表达量及核阳性率与TNF-a的升高呈正相关,这表明NF-κB表达的增多伴有神经细胞内Caspase-3的激活,即Caspase-3的核移位。大量文献也证实了脑出血后血肿周围存在上述反应,并认为它可能导致了脑出血后的细胞凋亡过程。由此推断NF-κB介导的Caspase-3信号途径参与脑出血后的炎症反应,并加重神经元损伤和凋亡。结论1、Caspase-3、TNF-α和NF-κB在大鼠脑出血后的血肿周围脑组织表达增高。2、Caspase-3、NF-κB、TNF-α在脑出血后脑水肿周围表达有相关性。