肝移植是目前治疗终末期肝脏疾病的一种有效方法。与其它器官移植相比，肝移植的优越性主要表现在排斥反应较易控制，特别是在肝肾、肝胰等多器官联合移植中，肝移植可有效诱导受体对肾、胰形成免疫耐受，从而对其他器官的形成和存活发挥保护作用[1]。近年来，辅助性T细胞和抑制性T细胞在肝移植术后免疫反应中的作用研究越来越受到重视。T细胞是参与移植排斥反应和诱导免疫耐受的免疫细胞之一，在机体内发挥着极其重要的调节和效应作用。通过大量的动物和临床试验，一些免疫细胞包括T细胞、淋巴细胞及细胞因子等在移植免疫中作用机制和作用特点被陆续报道，部分免疫细胞也开始应用于临床实践。肝移植术后患者机体免疫功能的改变，主要表现在T淋巴细胞亚群及其细胞因子水平的变化，在排斥反应和免疫耐受患者的外周血中各亚群及细胞因子的水平存在差异表达，而其最终在机体中的平衡是维持患者发生持续性免疫耐受的保证。调节性T细胞（辅助T细胞和抑制性T细胞）是维持机体排斥反应和免疫耐受平衡的主要因素，而排斥反应与免疫耐受的发生取决于效应性T细胞和调节T细胞之间的相互博弈，要限制效应T细胞的作用，减小肝移植术后病人机体排斥反应，就必须诱使调节性T细胞积极发挥抑制效应。目前研究表明，调节性T细胞对多种免疫细胞及其细胞因子具有调节效应[2-4]，在动物实验中已证实调节性T细胞具有显著减轻移植物抗宿主病发生的作用机制[5-7]。此外，有学者应用体外扩增的CD4⁺CD25⁺T细胞来降低小鼠移植后发生的移植物抗宿主排斥反应[8-10]，取得了相当的进展。本课题以肝移植术后长期生存（即产生免疫耐受）患者的外周血为研究对象，检测血中Th1细胞、CD3⁺CD8^low抑制性T细胞（Ts）及CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg的表达水平，探讨肝移植术后产生免疫耐受患者外周血中Th1细胞、CD3⁺CD8^low抑制性T细胞（Ts）及CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg的表达特点及其与FK506之间的相关性，为肝移植术后患者产生免疫耐受和用药指标提供指示性依据。目的通过检测肝移植术后长期生存患者外周血中Th1细胞和CD3⁺CD8^low抑制性T细胞（Ts）及CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg水平，探讨肝移植术后长期生存患者外周血中T淋巴细胞亚群的变化规律，分析三者变化与FK506的相关性，证实其在临床检验和免疫学中的诊断意义。方法1.选取重庆某医院肝移植术后持续治疗患者40例：男23人，女17人；年龄段在45⁵8岁之间，病人肝移植术后未发生排斥反应。将肝移植组分为存活2-3年患者，共20例；存活8-10年患者，20例；健康人20例，体检各项指标均在正常范围内。集中采集所选对象静脉外周血，肝素抗凝，编号备用。2.实验方法2.1血清学检测40例肝移植术后患者及其20例健康人的肝功能，评估AST, ALT,GGT, ALB以及FK506血药浓度2.2外周血中单个核细胞（PBMC）的分离；2.3淋巴细胞的培养；2.4淋巴细胞的收集与分组；A组：Th1细胞（IL-2）检测组；B组：CD3⁺CD8low抑制性T细胞检测组；C组：CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg检测组；2.5流式细胞检测A组加入Anti-Human IL-2/PE10ul；B组加入Anti-Human CD3/PE、Anti-Human CD8/FITC各10ul；C组加入Anti-Human CD4/PerCP-Cy5.5、Anti-Human CD25/PE以及Anti-HumanFoxp3/APC各10ul；流式细胞仪检测外周血单个核细胞的比例。3.统计学分析处理数据采用SPSS13.0统计软件，计量资料以x±s表示，并采用方差分析和t检验处理，P<0.05时代表差异具有显著性。相关性分析采用Pearson法，P<0.05代表具有相关性。结果1、肝移植术后生存2-3年患者以及肝移植术后生存8-10年患者肝功能与健康对照组AST、ALT和ALB三项指标都无显著性差异（P>0.05），而GGT在肝移植术后患者中相对于健康对照组显著增高（P<0.01）。术后血药浓度情况：肝移植术后生存2-3年患者血清中FK506为7.58±0.47ng/ml；8-10年患者，血清中FK506为4.21±0.3ng/ml，显著高于健康对照组中的血药浓度；同时，肝移植后生存8-10年患者血清中FK506浓度显著低于生存2-3年患者，有统计学意义。2、20名健康人和40名肝移植术后患者外周血中Th1细胞、CD3⁺CD8^low抑制性T细胞及CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg细胞水平：肝移植术后2-3年患者外周血中Th1细胞约占32.15±3.05%， CD3⁺CD8^low抑制性T细胞占23.34±2.87%，CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg占17.87±3.22%；肝移植术后8-10年患者外周血中Th1细胞约占18.71±2.97%， CD3⁺CD8^low抑制性T细胞占18.32±2.54%，CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg占10.76±2.21%；健康人外周血中Th1细胞约占12.26±2.35%，CD3⁺CD8^low抑制性T细胞占10.74±3.21%，CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg占6.43±1.12%。与健康人组比较，肝移植术后生存2-3年患者组外周血中Th1（IL-2）细胞、CD3⁺CD8^low抑制性T细胞及CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg细胞百分比计数水平均显著高于健康人对照组水平（P<0.05），有统计学意义；生存8-10年患者CD3⁺CD8^low抑制性T细胞百分比计数水平显著高于健康人对照组水平（P<0.05）；而Th1细胞及CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg细胞百分比计数较生存2-3年患者中的水平显著降低（P<0.05），有统计学意义；生存8-10年患者中CD3⁺CD8^low抑制性T细胞较生存2-3年患者中的水平虽然也降低，但无显著性差异（P>0.05）。此外，生存8-10年患者中这些T细胞亚群检测结果较2-3年患者更接近健康对照组的水平。3、通过对40例肝移植术后长期生存患者外周血中FK506与Th1细胞、CD3⁺CD8low抑制性T细胞及CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg表达散点图Pearson和相关性分析，可知FK506浓度与Th1（IL-2）、CD3⁺CD8^low抑制性T细胞及CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg呈直线正相关。结论1、肝移植术后长期生存患者同健康人比较，其外周血中Th1细胞、CD3⁺CD8^low抑制性T细胞及CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg水平均高于健康人组水平，肝移植术后患者产生免疫耐受一定程度上取决于Th1细胞、CD3+CD8^low抑制性T细胞（Ts）以及CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg之间的动态平衡。2、肝移植术后患者外周血中Th1细胞、 CD3+CD8^low抑制性T细胞及CD4⁺CD25⁺Foxp3+Treg细胞含量变化结合肝生化指标比较可能作为术后患者免疫抑制药物应用的用药指标。