透明质酸(HA)是一种广泛存在于动物各种组织和体液中的线性高分子多糖,尤其是结缔组织中,含量最高。作为脊椎动物组织的细胞外基质(ECM)的一个重要组成部分,HA在细胞黏附、迁移、增殖和分化等方面都发挥着重要作用。尽管不同来源的HA具有相同的主要结构,它们的分子量却差异很大,范围从10kDa至5000kDa。分子量大小不同的HA片段往往表现出不同的甚至相反的生物学功能,West等发现3～16个双糖单位的HA片段在体内具有促血管生成作用,在体外可促进内皮细胞的增生。而高分子量HA抑制血管生成并且对炎症因子不起作用。目前,HA主要是从微生物发酵获得,少量从动物组织中提取。发酵法或提取法制备的HA分子量一般在1000kDa至3000kDa。一般来说,低分子HA(LMW-HA),分子量范围从10kDa至500kDa,是通过物理或化学降解法获得。然而,如果采用酸碱或氧化剂降解HA来制备LMW-HA及寡聚HA (oligo-HA),HA降解的同时常伴随着单糖残基结构的破坏。当分子量降低到100kDa以下时,HA分子链的一级结构将显著改变。因此,分子量低于100kDa的HA,特别是HA寡糖,通常通过透明质酸酶降解法来制备,该法效率高、反应条件温和,因此越来越受到人们的重视。透明质酸酶是一类能够降解HA的酶的统称。HA为组织胞外基质(ECM)中具有保持水分等生理作用的大分子亲水性物质,而将透明质酸酶通过局部注射给药,可降解ECM中的高黏度HA,暂时降低细胞间质的黏性,可促使皮下输液、局部积贮的渗出液或血液加快扩散,为一种重要的药物扩散促进剂。临床用作药物渗透促进剂促进药物的吸收、促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散。然而,动物来源的透明质酸酶是有限的,微生物发酵制备透明质酸酶不受原料来源的限制。目前,许多微生物,包括产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、消化链球菌属和链霉菌属的某些菌株都可产生透明质酸酶。但是,目前微生物透明质酸酶的酶活太低,远未达到工业化应用的要求。有报道的透明质酸酶酶活产量最高的为591U/mL。因此有必要筛选透明质酸酶高产菌株。本研究从自然界中筛选出一株高产透明质酸酶菌株,并进行了菌种鉴定、发酵工艺、纯化工艺、酶学性质研究,获得了该酶的基因序列及氨基酸残基序列,还用该酶制备了oligo-HA,并对所制备的oligo-HA的活性进行了研究。1.透明质酸酶高产菌株的筛选和菌株A50的鉴定从空气中筛选出一株高产透明质酸酶菌株,革兰氏阳性菌,命名为A50。将菌株A50的16S rDNA序列进行测序,提交到GenBank。基于在NCBI中已知的16S rDNA序列的同源分析表明,菌株A50与许多芽孢杆菌菌株有99%的相似性。因此,该菌株A50是一种芽孢杆菌,我们把它命名为Bacillus sp. A50。2. Bacillus sp. A50透明质酸酶发酵研究(1)对发酵培养基组成进行优化,包括碳源、氮源及其他成分,最终确定了Bacillussp.A50产透明质酸酶发酵培养基的最优配比,即：10g/L蛋白胨,10g/L水解乳蛋白,2g/LK2HPO4·3H2O,0.5g/LMgSO4·7H2O,5g/L葡萄糖(pH7.0)。(2)在优化发酵培养基的基础上,在10L发酵罐上对培养温度和时间、搅拌速度和通气量进行进一步研究,最后确定采用搅拌速度150r/min、通气量9L/min、培养温度35℃、培养时间8h,在此条件下发酵后发酵液上清的活性为1.5×105U/mL。3. Bacillus sp.A50产生的透明质酸酶的分离纯化经过离心、盐析、离子交换和凝胶过滤层析,Bacillus sp. A50产生的透明质酸酶比活为1.02×107U/mg,与发酵上清相比,纯度为发酵上清透明质酸酶的21倍,酶活收率为25.38%。在DEAE阴离子交换柱中,蛋白质用0-0.5mol/L NaCl洗涤。分别收集各个洗脱峰的洗脱液,分析透明质酸酶活性。结果发现,仅有1个洗脱峰具有透明质酸酶活性。后经Superdex200柱进一步纯化,在SDS-PAGE凝胶获得单一蛋白条带,分子量约120kDa,将其命名为HAase-504. HAase-B性质研究(1)温度和pH对HAase-B酶活的影响HAase-B最适反应温度为44℃,在40℃和44℃之间酶活均很高,且相对稳定。但在46℃下,酶活仅为原来的25.6%。当温度达到60℃以上时,HAase-B完全失去活性。在40℃或45℃下温浴120min后,HAase-B酶活变化不大,在550C下其稳定性很差。在55℃下温浴10min活性降低99%。HAase-B最适pH为6.5,在pH4.0和pH9.0的没有检测到活性。在pH5.0-6.0, HAase-B是最稳定的,温浴120min后,酶活维持90%以上的活性。(2)金属离子、金属离子螯合剂和表面活性剂对HAase-B酶活的影响金属离子Ca2+、Mg2+、Ni2+、Co2+和Ba2+都对HAase-B酶活有促进作用。底物溶液中含有100mmol/L CaCl2时,HAase-5表现出最高酶活,与不含金属离子的反应液相比,活性提高到154%。Zn2+(10mmol/L)和Cu2+(10mmol/L)能够明显抑制HAase-B酶活,抑制率为70%,当这两种离子的浓度达到50mmol/L和100mmol/L时,HAase-B酶活受到完全抑制。虽然金属离子的螯合剂(EDTA、EGTA和DFO)会降低HAase-B的活性,但不能完全抑制,甚至当金属离子螯合剂的浓度升高到100nmol/L时,HAase-B依然有活性。非离子表面活性剂(吐温80和Triton X-100)抑制HAase-B的活性,不同浓度下抑制率3%到30%。然而,离子型洗涤剂(SDS)在任何浓度下均完全抑制酶的活性。(3) HAase-B的底物特异性HAase-B能够降解HA、硫酸软骨素A (CSA)、硫酸软骨素C (CSC)、硫酸软骨素D(CSD),并且产生含有不饱和键的降解产物,在232nm有很强的吸收峰；而对于其他的多糖底物,HAase-B没有表现出任何活性。对HAase-B的动力学研究表明,降解HA反应,米氏常数(Km)为0.02ng/mL,最大速度(Vmax)为0.27A232/min。 HAase-B降解CSA的Km为12.30mg/mL,Vmax为0.20A232/min。(4) HAase-B的基因测序及序列分析通过对Bacillus sp. A50进行部分基因组测序,并与HAase-B的N端氨基酸残基序列及七段随机获取的氨基酸残基序列相比对,确定HAase-B基因的核苷酸序列由3324bp组成,并确定为细菌基因组的一部分。我们将获得的HAase-B的基因序列提交至GeneBank中。根据HAase-B基因的核苷酸序列推导其氨基酸残基序列,预测HAase-B的分子量和等电点分别为123242Da和5.05。HAase-B的氨基酸残基序列与糖胺聚糖裂解酶家族的其他成员对比结果显示,与HAase-B相似性最高的黄原胶裂合酶XalB的前体酶有46%的相似性,与GAG裂解酶家族的所有其它蛋白质相似性为31%至46%。与以上所有GAG裂合酶的保守区域相比,HAase-B的活性位点可能是N513、H563和Y572。将推导出的HAase-B氨基酸残基序列与以上所有GAG裂合酶氨基酸残基序列比对,我们还发现HAase-B的底物结合位点可能是R406、T409、 K413、N453、W455、H456、G460、N463、S467、N513、K519、 H563、Y572、V575、E578、D582、R626、A627、R630、M741和N742。5.用HAase-B制备oligo-HA及oligo-HA的生物活性研究HAase-B制备的oligo-HA的红外光谱与HA的欧洲药典参考图谱无明显差异。采用HPLC法检测含量,HAase-B制备的oligo-HA含量明显高于用盐酸降解制备的oligo-HA。这表明HAase-B制备的oligo-HA的化学结构是完整的,而用HCl降解制备的oligo-HA的结构发生了改变。HAase-B制备的oligo-HA具有显著的抗氧化活性。在化学水平,oligo-HA能够有效清除DPPH自由基,具有较强的还原能力；在细胞水平,当HaCaT人表皮角化细胞受到UVA和UVB照射损伤后,oligo-HA能够将细胞增殖率修复至正常水平,降低细胞内活性氧自由基的浓度。此外,由HAase-B降解制备的oligo-HA具有促进血管生成的能力。