Viperin蛋白是一种具有高效广谱抗病毒效应,并与内质网密切相关且受IFN诱导的生物大分子,属于干扰素刺激基因家族成员之一,研究证实Viperin蛋白能在干扰素及不同病毒等因素刺激下诱导表达并发挥抗病毒作用,参与细胞信号调节以及其他生物学相关作用。它在天然免疫中有重要地位,随着研究的不断深入,Viperin蛋白的抗病毒功能的机制越来越完善,其他生物学功能也正在不断被发现,因此,自发现以来,Viperin的相关研究受到越来越多的关注。扬子鳄是国家一级保护动物,距今已有2亿年的历史,在进化中有着重要的历史地位。对扬子鳄抗病毒能力以及免疫因子相关功能的了解,有助于自然保护区和野生扬子鳄疾病的控制和预防,保证扬子鳄的养殖科学、可持续化的发展。本研究通过扩增扬子鳄Viperin基因,用生物信息学相关方法对其进行全面分析,通过原核表达和真核表达来验证扬子鳄Viperin蛋白的抗病毒功能,以揭示其抗病毒功能的关键位点,对其免疫系统的完善认知将会对人类先天性免疫的研究产生重要意义。为研究扬子鳄Viperin基因的序列结构以及生物学功能,通过提取成年扬子鳄外周血液中的mRNA,经反转录得到cDNA,设计引物,对得到的cDNA进行PCR扩增,连接至pMD-19T载体上构建重组质粒,经PCR鉴定呈阳性的质粒进行序列测定。对测序得到的序列进行生物学信息分析,包括氨基酸序列分析、抗原性分析、进化树分析、同源性分析、以及蛋白结构和功能预测等。并将序列提交至GenBank数据库,登录号为KY464129。扬子鳄Viperin基因的完整ORF序列为1011bp,共编码336个氨基酸,前18个氨基酸为信号肽。成熟蛋白的分子质量为38kDa,等电点为8.72。扬子鳄Viperin蛋白包含N端结构域、SAM结构域以及C端结构域。三级结构显示,该蛋白主要由8段α螺旋,8段β折叠组成,与经典Viperin蛋白的结构一致,均为TIM桶状结构。通过同源性和进化树分析,扬子鳄Viperin基因与湾鳄同源性最高,为96.4%,在进化树处于同一分支。对扬子鳄不同组织中Viperin基因的表达水平进行测定和分析。发现Viperin基因在各组织中的表达水平从高到低依次为血液,小肠,肝脏,肾脏,心脏和肌肉组织。不同年龄组血液中Viperin基因的表达水平也有差异,试验结果为扬子鳄Viperin基因的表达调控机制和功能的研究奠定了基础。将Viperin基因片段与pET-28a进行连接,原核表达并纯化蛋白后免疫新西兰兔,收集免疫4次的血清并通过ELISA效价测定,成功制备出Viperin的多克隆抗体。将Viperin完整基因和截短体分别连接到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A上,转染至鸡成纤维细胞内,用新城疫病毒感染已转染扬子鳄Viperin的鸡成纤维细胞,以检测Viperin蛋白的抗病毒能力,发现Viperin完整蛋白的抗病毒能力最高,N端截断Viperin蛋白也具有一定的抗病毒能力,而C端截断的Viperin蛋白几乎没有抗病毒能力,抑制率实验结果显示完整Viperin蛋白对于鸡成纤维细胞感染新城疫病毒出现100%细胞病变时有83.75%的抑制率,N端截断Viperin有23.75%的抑制率,而C端截断Viperin的抑制率几乎没有,为2.3%。证明C端对扬子鳄Viperin蛋白抗的病毒能力有关键作用,以及通过间接免疫荧光试验确定了 Viperin定位在细胞质中,为今后研究扬子鳄Viperin的抗病毒机制奠定基础。综上所述,本课题研究了扬子鳄Viperin基因的生物信息学特点,探索了 Viperin在体内的表达量和体外抗病毒功能初步研究,发现扬子鳄Viperin和其他物种的Viperin具有同样的抗病毒功能特征,为更深入的研究Viperin的功能和先天免疫相关研究奠定了基础,也为扬子鳄的疾病预防和科学化管理提供了理论保障。