H.pylori导致的不同临床结局除了与环境因素以及宿主易感性相关以外，其毒力基因的差异也在胃疾病的发生发展中起到重要作用。目前在东亚地区没有任何一个确定的H.pylori毒力基因具有疾病特异性，尚不能作为与临床结局相关的潜在标志基因。确定H.pylori菌株与疾病相关的毒力基因对于高危人群的筛查，临床疾病诊断以及预后的估计都有至关重要的作用。本室在前期研究中，采用抑制性消减杂交(SSH)以及斑点杂交的方法构建了H.pylori胃癌来源株和浅表性胃炎来源株差异基因文库，对筛选出的差异基因进行生物信息学分析，发现slyD基因为胃癌来源株的高拷贝基因，可能与胃癌发生发展密切相关，其编码产物SlyD蛋白具有肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PPIase)活性，属于PPIase-FKBP(FKS06 binding protein)家族，但H.pylori slyD基因确切的功能及生物学效应尚未可知。我室前期已经从DNA水平探讨了slyD基因与胃疾病的相关性;并纯化了SlyD蛋白用于该蛋白的单一效应的观察以及蛋白质相互作用网络的搭建;进行了基因功能获得研究，将slyD基因通过瞬时转染及稳定转染导入细胞中，以观察细胞生物学行为的改变。目前，解读未知功能基因的另一个重要策略是基因功能失活体的构建，利用基因敲除(knock out)技术构建突变体，进行基因功能分析，进而研究目的基因与表型性状之间的关系，是研究微生物基因功能的一种行之有效的遗传学操作方法，本研究拟利用基因敲除技术从功能失活的角度解读slyD基因生物学效应。　　 目的：　　 本研究拟根据同源重组原理，利用基因工程技术方法对H.pylori26695 slyD基因进行基因敲除，构建slyD基因敲除突变株，进一步比较遗传背景相同的野生株与突变株在与AGS细胞体外共培养时对细胞增殖效应影响的差异，旨在观察slyD基因的功能及其与疾病的相关性，为寻找胃疾病相关的H.pylori毒力基因标志物提供重要的实验依据。　　 方法：　　 1、常规方法进行H.pylori26695菌株培养及DNA提取。2.构建打靶载体及鉴定:采用PCR方法以H.pylori26695为模板扩增slyD基因上、下游同源臂，以质粒PYCYC184为模板扩增氯霉素抗性片段，利用分子生物学方法将目的片段与表达载体pBluescriptⅡ KS(+)/LIC连接，通过蓝白筛选、氯霉素抗性筛选、酶切、测序四种方法鉴定打靶载体。3、突变株的构建及鉴定:利用同源重组的方法将打靶载体通过自然转化进入H.pylori，通过氯霉素抗性筛选、酶切、测序以及蛋白表达的情况鉴定突变株。4、H.pylori与AGS细胞共培养，用CCK-8法检测野生株/突变株对AGS细胞增殖效应的差异。5、统计分析采用SPSS16.0软件，两独立样本t检验，P＜0.05有统计学差异。　　 结果：　　 1、成功扩增目的基因片段，包括slyD上游同源臂732bp，slyD下游同源臂647bp，氯霉素抗性片段789bp。　　 2、成功构建slyD基因打靶载体:蓝白筛选出白色E.coli菌落;该菌落可以在含有34ug/ml氯霉素的LB平板上生长;进一步采用单酶切、双酶切及测序法鉴定该E.coli菌落中的质粒为打靶载体。　　 3、成功构建H.pylori26695 slyD基因突变株:成功转化的H.pylori菌落在含有8ug/ml氯霉素的BHI平板上生长;提取菌落DNA进行单、双酶切鉴定并将酶切产物经测序鉴定，与目的片段一致;Western blot法鉴定SlyD蛋白，突变株的上清培养液以及沉淀中均不含有SlyD蛋白。　　 4、分别采用1∶10，1∶50，1∶100，1∶150;1∶200细胞与细菌比例进行H.pylori与AGS细胞共培养，选择1∶50为最佳浓度比例。在此浓度作用下，观察突变株与野生株对AGS细胞增殖效应的影响。结果发现与对照组相比，slyD基因野生株和突变株均能够促进AGS细胞增殖(P＜0.001)，野生株与AGS细胞共培养组48h与24h相比细胞增殖倍数为2.17±0.17倍。突变株与AGS共培养组为1.99±0.13倍。空白对照组细胞增殖倍数为1.56±0.11。突变株与野生株组相比促进AGS细胞增殖的作用显著下降(P=0.006)。　　 结论：　　 本研究成功构建了H.pylori slyD基因失活突变株，并在此基础上观察到slyD基因突变株促进AGS细胞增殖的能力显著下降，推测slyD基因具有促进细胞增殖的生物学效应。