骨肉瘤是起源于间叶组织的恶性肿瘤,是儿童和青少年发病率最高的一种原发性恶性骨肿瘤。随着新辅助化疗在临床上的广泛开展,骨肉瘤患者的5年生存率有了很大改善,但由于骨肉瘤容易出现耐药、复发和早期转移等特点,导致骨肉瘤的5年生存率维持在70%左右,肿瘤病灶的远处转移是最常见的死亡原因。近年来随着肿瘤干细胞学说的提出,肿瘤干细胞研究已逐渐成为人们在肿瘤研究中的热点领域,并且己在多种肿瘤组织中证实了肿瘤干细胞的存在,如脑肿瘤、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌等。肿瘤干细胞与正常干细胞具有很多相似的特性,均有自我更新能力、多向分化潜能等,因此肿瘤干细胞的存在可能是临床化疗失败的根本原因。对于肿瘤干细胞的来源,目前学术界尚无定论。但可以明确的肿瘤干细胞的形成是细胞内原癌基因和抑癌基因的生理平衡被破坏后引起,在有些情况下还涉及到上皮间质化转变(EMT)。EMT是指已经分化成熟的上皮细胞获得间质细胞的生物学特性的生理过程,其在肿瘤发生过程中与肿瘤干细胞的形成及肿瘤细胞的浸润、转移等生物学功能关系密切。有研究发现,骨肉瘤在转移过程中受到多种信号通路和蛋白分子的调控,并且EMT的发生对骨肉瘤细胞发生转移有促进作用。EMT不仅调控多种肿瘤干细胞的形成及参与肿瘤耐药过程,而且其自身的发生也受到复杂信号通路的调控,Wnt、Hedgehog、TGF-β、核因子κB及Notch等信号通路,这些信号通路也在诱导肿瘤细胞耐药中同样发挥重要作用。因此,通过研究这些信号通路在骨肉瘤干细胞形成、耐药及EMT转化之间的作用机制,特异性的针对骨肉瘤干细胞的耐药、转移等特征性的调节通路进行靶向治疗,对提高骨肉瘤的治疗效果将会产生重大意义。本课题通过使用低浓度阿霉素对骨肉瘤干细胞样细胞的富集作用及诱导其EMT的发生,发现Notch信号通路在维持骨肉瘤干细胞特征和调控EMT过程中发挥重要作用,特异性抑制Notch信号通路可以有效的抑制骨肉瘤干细胞特性表达及降低骨肉瘤的迁移、成瘤能力,为骨肉瘤的靶向治疗和联合用药提供可靠的实验基础。第一部分低浓度阿霉素在体外诱导骨肉瘤干细胞特性的作用研究目的:肿瘤干细胞学说激发了人们对骨肉瘤干细胞与化疗耐药之间的相关性研究,但目前针对骨肉瘤干细胞与化疗耐药之间的具体机制尚不明确。本课题拟探讨低浓度阿霉素对骨肉瘤干细胞特性的影响,阐明其作用机制,丰富和拓展骨肉瘤肿瘤干细胞特性的研究。方法:用CCK-8方法检测不同浓度阿霉素对骨肉瘤细胞增殖的改变情况,流式细胞仪检查低浓度阿霉素对骨肉瘤特异性干细胞表面标志物表达的影响,荧光定量PCR检测骨肉瘤内干细胞细胞转录因子的转录,无血清悬浮培养实验考察骨肉瘤细胞的成瘤能力。结果:1、不同浓度阿霉素均可导致骨肉瘤细胞系143B-TK和U20S细胞形态发生改变,引起细胞增殖受到明显抑制;2、低浓度阿霉素可引起两种骨肉瘤细胞系的干细胞标志物CD-117Stro-1双阳性率表达增高;3、低浓度阿霉素可增强骨肉瘤细胞的悬浮成球能力;4、低浓度阿霉素可以促进骨肉瘤肿瘤干细胞相关基因表达水平增加。结论:低浓度物阿霉素能够增强肿瘤干细胞特性和转移能力,从临床骨肉瘤治疗的角度表明,低浓度的阿霉素在杀伤骨肉瘤细胞的同时,也刺激了骨肉瘤干细胞特性的表达,促进骨肉瘤细胞的增殖和转移,为临床患者的治疗带来了负面效果。第二部分Notch信号通路在骨肉瘤干细胞样细胞中的作用研究目的:Notch信号通路对肿瘤发生发展过程的调控机制十分复杂,但在骨肉瘤干细胞领域,对Notch信号通路发挥怎样的作用尚未见报道。本课题本章节将通过低浓度阿霉素富集骨肉瘤干细胞样细胞,研究Notch信号通路对骨肉瘤细胞内肿瘤干细胞特性及转移能力的影响,为明确Notch信号通路在骨肉瘤干细胞中作用机制提供实验依据。方法:构建Notch信号报道载体慢病毒,筛选稳定转染的骨肉瘤细胞系,通过流式细胞仪检测低浓度阿霉素对Notch基因表达的影响;荧光实时定量PCR及Western blot方法,检测Notch信号通路相关受体Notch1及其下游靶基因Hes-1在阿霉素处理组合对照组中的转录及表达差异;平板克隆形成实验和无血清悬浮培养常作为体外评价Notch信号通路抑制剂对骨肉瘤干细胞样细胞成瘤能力的影响。结果:1、稳定转染Notch信号报道载体慢病毒的骨肉瘤细胞在低浓度阿霉素作用下,细胞内荧光信号明显增强;2、低浓度阿霉素组细胞Notch-1及下游靶基因Hes-1较对照组转录明显增高;3、Notch信号通路抑制剂DAPT可明显抑制低浓度阿霉素组中骨肉瘤细胞的克隆球数量和悬浮成瘤能力。结论:低浓度阿霉素可以促进Notch信号通路的激活,抑制Notch信号通路对骨肉瘤干细胞特性的表达产生抑制作用,证实Notch信号通路在调节骨肉瘤干细胞形成和耐药过程中发挥不可或缺的作用。第三部分Notch信号通路对骨肉瘤干细胞样细胞EMT的作用研究目的:EMT过程的激活是肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的关键机制,而Notch信号通路作为EMT过程中的信号调控途径之一,同样在肿瘤耐药、转移等过程中发挥重要的作用。但在骨肉瘤干细胞中,尚无文献报道骨肉瘤干细胞中是否涉及EMT转化,以及Notch信号通路对骨肉瘤干细胞EMT发挥何种调控作用。本章节将探查EMT转化在骨肉瘤干细胞样细胞中表达情况,验证及Notch信号通路对骨肉瘤干细胞EMT的调控作用,为骨肉瘤的靶向治疗研究提供新的思路和靶点。方法:采用Western Blotting检测骨肉瘤干细胞样细胞中EMT标志性分子的转录水平;通过细胞划痕修复实验和Transwell细胞迁移实验检测低浓度阿霉素诱导骨肉瘤干细胞样细胞的迁移、、浸润能力;使用Notch信号通路抑制剂检测对骨肉瘤干细胞样细胞中EMT的影响。结果:1、低浓度阿霉素可以促进骨肉瘤细胞发生EMT转化;2、低浓度阿霉素作用可增强骨肉瘤干细胞样细胞的移动和迁徙能力;3、Notch信号通路抑制剂可以对低浓度阿霉素诱导的骨肉瘤干细胞样细胞EMT过程产生抑制效果。结论:低浓度阿霉素可促进骨肉瘤干细胞样细胞发生EMT转化,并且Notch信号通路参与骨肉瘤干细胞浸润、转移过程,对骨肉瘤干细胞样细胞发生EMT发挥协同作用。