论文部分内容阅读
本研究在PK15细胞上增殖猪细小病毒7909株，将收获的细胞毒接种初妊母兔，母兔产出死胎。利用常规的酚-仿抽提与煮沸两种方法提取了全病毒核酸。NS1蛋白是PPV的主要非结构蛋白，该蛋白在病毒复制时能持续刺激机体产生抗体，由于病毒灭活后不表达NS1蛋白，因此，该蛋白可以作为检测灭活疫苗免疫与病毒感染的特异性诊断抗原。根据文献，设计了一对含两个限制性内切酶的特异性引物，利用PCR技术扩增猪细小病毒NS1全基因。经0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，在2.2kb左右出现了特异性条带，与预期结果一致。DNA凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，将纯化后的目的片段与PET32(a)表达载体连接，并转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，得到的转化子经酶切分析，筛选出符合阅读框的阳性重组子，构建重组表达质粒PET32-NS1．将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中，经IPTG诱导6h后，蛋白的诱导量达到最大。利用1O％SDS-PAGE电泳分析目的蛋白，诱导表达的融合蛋白分子量约为90.0KD，且以包涵体的形式存在。自制高免血清，对目的蛋白和空载体表达产物分别进行Western-blotting免疫印迹检测，发现只有目的蛋白与兔抗PPV阳性血清反应，提示重组表达的目的蛋白为PPV抗原成分，即NS1基因表达产物，同时也表明重组NS1蛋白具有抗原性。结构蛋白VP2是PPV的主要免疫原性抗原，是抗原决定簇的主体，由VP2构建的真核表达载体有望研制成为新型的核酸疫苗。本研究利用PCR技术扩增出VP2全基因，经0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，在1.8kb左右出现了特异性条带，与预期结果一致。并将NS1基因与VP2基因分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(＋)上，构建真核表达载体pcDNA-NS1，pcDNA-VP2．将所获得的重组阳性质粒分别接种小鼠，采集血清，经中和试验检测，pcDNA-VP2血清的中和抗体水平为1∶11，而NS1基因所构建的重组质粒未检测出中和抗体。表明VP2基因可以做为研制核酸疫苗的候选保护性抗原。