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目的:探讨辅助降糖颗粒与二甲双胍联合用药对ZDF大鼠胰岛素抵抗的作用及机制,为中西药联合应用提供科学依据,为临床用药提供指导。方法:采用随机对照设计方法,动物实验选取自发性2型糖尿病动物模型ZDF(fa/fa)大鼠28只,pumina#5008饲料诱导性喂养4周,不同次随机血糖≥11.1 mmol/L纳入实验。按体重、随机血糖随机分为:模型组、二甲双胍组、辅助降糖颗粒组(降糖颗粒组)、辅助降糖颗粒联合二甲双胍组(联合组),每组7只;另设7只同周龄正常ZDF(fa/+)大鼠为正常组,连续干预6周。实验过程中观察记录大鼠一般情况、体重、空腹血糖,第6周分别进行OGTT、ITT实验;6周后大鼠麻醉、取血,分别冻存和固定肝脏,检测血清中IR相关指标FBG、Fins和HOMA-IR,血脂指标TG、TC和FFA,肝肾功能指标AST、Scr和BUN,氧化应激和炎性细胞因子MDA、SOD、CAT和TNF-α,以及细胞因子Adiponectin、Resistin;检测肝脏糖原含量,行HE、PAS染色观察肝脏病理形态变化;高通量测序检测肝脏microRNAs表达,NCBI、The Gene ontology、KEGG、TIGR、miRBase数据库对差异microRNAs进行生物信息学分析,预测靶通路;Western blot 检测 IRS1ser307/ser612/ser1101/Tyr989、PI3K、Akt、GSK-3β 磷酸化水平以及 Real time-PCR检测肝脏InsR、G-6-P、PEPCKmRNA表达,来验证microRNAs生物信息学分析结果。细胞实验采用雄性SD大鼠50只,适应性喂养1周,按体重随机分为:正常组、二甲双胍组、辅助降糖颗粒组(降糖颗粒组)、辅助降糖颗粒联合二甲双胍组(联合组),每组10只,每日早晚各给药1次,连续给药7次后麻醉取血获得含药血清。H4IIE肝细胞常规复苏、培养,胰岛素浓度为10-6mol/L的培养基诱导36 h建立肝细胞胰岛素抵抗模型,含药血清进行干预后,CCK-8法检测细胞活性;Westernblot和Real time-PCR检测胰岛素信号通路关键靶点基因、蛋白表达,验证动物实验结果。结果:1.血清学检测:①在改善IR和糖脂代谢方面,与正常组大鼠比较,模型组大鼠血清FBG、Fins和HOMA-IR明显升高(P<0.01或P<0.05),OGTT、ITT试验峰值延后(P<0.01或P<0.05),体重、肝重、肝重/体重以及TG、TC和FFA显著升高(P<0.01或P<0.05),而肝糖原含量显著降低(P<0.01);与模型组比较,联合组显著降低大鼠FBG、Fins、HOMA-IR、体重、肝重、肝重/体重以及TG、TC和FFA(P<0.01或P<0.05),显著升高肝糖原含量(P<0.01),而且效果优于二甲双胍组和降糖颗粒组(P<0.01或P<0.05)。②在改善氧化应激和细胞因子方面,与正常组大鼠比较,模型组大鼠血清 MDA、Resistin、TNF-α 显著升高(P<0.01 或 P<0.05),而 SOD、CAT、Adiponectin 水平显著降低(P<0.01 或 P<0.05);联合组大鼠血清 MDA、Resistin、TNF-a显著降低(P<0.01 或P<0.05),SOD、CAT、Adiponectin 水平显著升高(P<0.01 或 P<0.05),其中调节MDA、SOD、CAT、Adiponectin、TNF-α的效果优于二甲双胍组、降糖颗粒组(P<0.01或P<0.05)。③在肝肾功能方面,各组间AST无差异;模型组Scr、BUN较正常组显著升高(P<0.01),而二甲双胍组、降糖颗粒组、联合组较模型组显著降低(P<0.01),联合组与二甲双胍组比较Scr显著降低(P<0.05)。2.形态学检测:HE染色显示各药物干预组肝细胞较模型组排列整齐、脂肪样变性减轻、炎细胞浸润减少;PAS染色显示各药物干预组较模型组胞质中紫红色糖原颗粒分布增多,联合组更为明显。3.microRNAs生物信息学分析:药物干预6周后,进行大鼠肝脏microRNA测序及差异基因趋势分析发现,与正常组、模型组比较,二甲双胍组rno-miR-182、rno-miR-33-3p、rno-miR-33-5p、rno-miR-3553、rno-miR-96-5p发生差异性趋势变化,降糖颗粒组rno-miR-122-3p、rno-miR-33-3p、rno-miR-33-5p、rno-miR-22-3p 发生差异性趋势变化,联合组 rno-miR-122-3p、rno-miR-33-3p、rno-miR-33-5p、rno-miR-742-3p、rno-miR-22-3p发生差异性趋势变化(P<0.01或P<0.05);对差异趋势显著的microRNA进一步行靶基因预测、功能分析以及Pathway分析显示,与正常组、模型组比较,二甲双胍组、降糖颗粒组、联合组均显著性影响胰岛素信号传导通路,但联合组显著性较二甲双胍组、降糖颗粒组更强。4.Western blot和Real time-PCR检测:与模型组比较,联合组大鼠肝脏IRS1ser307/ser612/ser1101 蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01 或 P<0.05),IRS1Tyr989、PI3K、Akt、GSK-3β蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.01或P<0.05),InsRmRNA表达显著升高(P<0.01),G-6-P、PEPCKmRNA表达显著降低(P<0.01);而与二甲双胍组、降糖颗粒组比较,联合组调控以上蛋白和基因表达的效果显著,存在差异性(P<0.01 或 P<0.05)。5.肝细胞检测结果:对胰岛素抵抗肝细胞活性检测显示,模型组含药血清干预后细胞活性较正常组显著降低(P<0.01);二甲双胍组、降糖颗粒组、联合组较模型组显著升高(P<0.01);联合组较二甲双胍组、降糖颗粒组显著升高(P<0.01或P<0.05)。Western blot和Real time-PCR检测显示,联合组含药血清干预后细胞较模型组IRS1ser307/ser612/ser1101蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01 或 P<0.05),IRS1Tyr989、PI3K、Akt、GSK-3β蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.01或P<0.05),InsRmRNA表达显著升高(P<0.01),G-6-P、PEPCK mRNA表达显著降低(P<0.01);而与二甲双胍组、降糖颗粒组比较,联合组调控以上蛋白和基因表达的效果显著,存在差异性(P<0.01 或 P<0.05)。结论:辅助降糖颗粒联合二甲双胍明显改善糖尿病大鼠IR以及糖脂代谢紊乱,促进糖原合成,效果优于二甲双胍、辅助降糖颗粒单独应用,其机制可能是通过调节microRNA差异表达,来调控胰岛素信号传导通路中IRS1、PI3K、Akt、GSK-3磷酸化及InsR、G-6-P、PEPCK基因表达,发挥改善IR的作用;此外,辅助降糖颗粒联合二甲双胍还具有抗氧化,调节细胞因子Adiponectin、Resistin、TNF-α的作用,这可能也是其作用机制之一。