论文部分内容阅读
背景髓系白血病包括急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)和慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML,简称慢粒)。AML是最常见急性白血病,疾病发展迅速,自然病程数月。以蒽环类和阿糖胞苷为主的联合化疗是非急性早幼粒细胞白血病的AML的主要治疗方法,但治疗疗效并不理想。由于AML疾病性质高度异质,一些基于AML发生发展相关分子为靶点的药物不能满足临床治疗的需要。因此,深入研究AML发生发展的机制,发现新的潜在治疗靶标是重要科学问题。慢性髓细胞白血病包含慢性期、加速期和急变期。酪氨酸激酶抑制剂对慢性期疗效好,对加速期和急变期疗效差。高三尖杉酯碱(HHT)是我国从三尖杉属植物中分离出的抗肿瘤生物碱,研究发现HHT通过不依赖于BCR/ABL的机制发挥作用,对于CML加速期和急变期,以及对酪氨酸激酶抑制剂耐药的CML患者均有效。但HHT有较强的心脏、骨髓抑制、高血糖等毒副作用,临床用药受限,因此发现与HHT具有协同作用的增敏分子,降低HHT的临床有效用药剂量,是提高HHT药物效应的重要策略。叉头框蛋白M1(FoxM1)是在有丝分裂G1/S和G2/M期中起正向调控的转录因子,在一些实体瘤中FoxM1过度表达,通过诱发细胞异常增殖参与恶性转化,而在大多数正常成熟组织细胞FoxM1不表达,因此被认为是抗肿瘤的潜在靶标,但FoxM1在急性白血病中作用的研究报道少见。原癌基因B淋巴细胞瘤-2(BCL2)是最受关注的细胞凋亡抑制基因,FoxM1能否调控BCL2在AML中发挥作用值得关注。HHT属于细胞周期特异性药物,FoxM1主要通过调控细胞周期相关分子转录介导细胞增殖参与肿瘤发生,抑制FoxM1可提高实体瘤细胞对化疗药物敏感性。FoxM1和HHT都可以调控细胞周期,靶向干预FoxM1表达是否可以协同增敏HHT抗白血病效应未见报道。目的1.探讨FoxM1及其调控的BCL2在AML发生发展中作用。2.探讨抑制慢粒急变细胞K562的FoxM1对于增强HHT的药物敏感性。方法1.qRT-PCR和细胞免疫荧光方法检测AML初诊组(de novo)、治疗达完全缓解组(CR)和难治复发组(RR)各17例患者FoxM1 mRNA水平和蛋白表达;转染FoxM1siRNA抑制白血病HL60和K562细胞FoxM1表达,观察对细胞生长、克隆形成和细胞凋亡的影响;qRT-PCR和Western Blot法检测FoxM1对BCL2表达的影响,双荧光素酶活性实验检测FoxM1是否可以靶向作用于BCL2启动子区域进而影响BCL2表达。2.HHT以不同浓度(0μmol/L,0.015μmol/L,0.03μmol/L,0.045μmol/L)和最低起效浓度不同时间点(0.015μmol/L,0h,24h,48h,72h)作用K562细胞,qRT-PCR和Western blot法检测FoxM1 mRNA和蛋白表达;以0.015μmol/L HHT作用K562细胞后转染FoxM1 siRNA,观察沉默K562细胞FoxM1后HHT的药物敏感性、细胞增殖和凋亡效应以及FoxM1相关靶分子c-myc和Sp1表达状况。结果1.AML de novo组患者骨髓标本FoxM1表达较正常对照显著升高,CR组FoxM1表达较初诊组降低,RR组FoxM1表达较初诊组进一步升高。转染FoxM1 siRNA沉默HL60和K562细胞FoxM1表达后,细胞生长速率下降,细胞克隆形成能力降低,细胞凋亡率升高,BCL2表达降低,双荧光素酶活性实验证实FoxM1可靶向作用BCL2启动子区域调控BCL2表达。2.随着HHT浓度增加和作用时间延长FoxM1表达逐渐降低,说明HHT抑制K562细胞FoxM1表达;HHT处理K562细胞后转染FoxM1 siRNA,细胞生长和克隆形成显著下降,细胞凋亡增加,因此抑制FoxM1可增加K562细胞对HHT的药物敏感性;FoxM1siRNA组c-myc和Sp1表达显著降低,表明FoxM1可正性调控c-myc和Sp1表达。结论1.证实FoxM1可通过靶向调控BCL2促进AML发生发展,干预FoxM1表达可抑制细胞增殖并促进细胞凋亡,提示FoxM1是治疗AML的潜在靶标。2.HHT可以抑制白血病K562细胞FoxM1表达,干扰FoxM1可增敏HHT的药物效应。