近年来,代谢异常在肿瘤中的影响被广泛关注,且被认为是肿瘤最重要的标识之一。正常细胞依赖三羧酸循环产生能量,而肿瘤细胞即使在氧气充足的情况下也主要依赖糖酵解产生能量,以维持其快速增殖,这就是所谓的沃伯格效应,也称有氧糖酵解。肿瘤细胞吸收的葡萄糖大多数经过糖酵解生成乳酸,而且生成大量的中间产物,为合成肿瘤细胞异常增殖所需的核苷酸、磷脂和蛋白质等提供物质基础。可见沃伯格效应在细胞的恶性增殖和转移中起着关键的作用,可以为肿瘤治疗提供潜在的靶标,然而其中具体的分子机制尚未明晰。SIRT6作为第三类去乙酰化转移酶家族重要的一员,具有去乙酰化酶活性和单ADP转移酶活性等。SIRT6的缺失的小鼠在生命的早期表现出致命的低血糖症,伴随着循环血中的IGF-1的水平的急剧下降。随后,在小鼠的心脏组织中,SIRT6被证明能够与c-Jun结合并抑制IGF-Akt信号通路。并且在肌肉和肝脏组织中,SIRT6过表达可以增强细胞对胰岛素的敏感性。以上显示SIRT6与糖代谢有着密不可分的联系。本研究利用SIRT6乙酰化突变体SIRT6Y257F,在肿瘤细胞中探讨SIRT6的去乙酰化转移酶活性对肿瘤增殖、转移及沃伯格效应的影响,并进一步探讨了SIRT6与CDK4-CCND1信号通路的调控关系,以及SIRT6去乙酰化酶活性对CDK4蛋白活性的影响。为SIRT6调控沃伯格效应提供新的分子机制,为SIRT6作为癌症治疗的潜在靶标提供理论基础。本研究获得的主要研究结果如下:1.SIRT6抑制肿瘤增殖依赖其去乙酰化活性为了确认SIRT6与肿瘤恶性增殖的关系,我们首先在多个肿瘤中敲低了SIRT6的表达。MTT实验结果显示SIRT6表达下调引起肿瘤细胞异常增殖;Brdu实验也显示SIRT6表达下调的细胞表现出更多的阳性率。软琼脂实验显示SIRT6表达下调细胞具有更高的克隆形成能力。除此之外,动物实验也显示SIRT6表达下调细胞在体内形成的肿瘤体积显著增大,肿瘤重量明显增重。为了进一步验证SIRT6去乙酰化酶活性对异常增殖的影响,我们构建了一个SIRT6去乙酰化突变失活体SIRT6Y257F,即将SIRT6第257位亲水的酪氨酸突变为疏水的苯丙氨酸。通过在SIRT6表达下调的细胞中恢复SIRT6及SIRT6Y257F的表达,我们发现SIRT6的表达恢复挽救了SIRT6表达下调引起的细胞增殖能力、克隆形成能力和体内成瘤能力。然而,在SIRT6表达下调的细胞中恢复SIRT6去乙酰化酶失活体SIRT6Y257F,却不能挽救SIRT6表达下调引起的细胞增殖能力、克隆形成能力和体内成瘤能力。这些结果表明,SIRT6抑制肿瘤细胞增殖能力依赖其去乙酰化酶活性。2.SIRT6抑制肿瘤迁移和侵袭依赖其去乙酰化活性除了对增殖的影响,我们也对SIRT6表达下调与肿瘤转移的关系进行了探讨。划痕实验显示SIRT6表达下调的细胞相对于对照组具有更强的迁移能力;进一步利用Tranwell小室进行细胞迁移和侵袭能力检测,结果显示SIRT6表达下调增强了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。因为细胞黏附常和迁移侵袭相关,我们进行了细胞黏附实验,结果显示SIRT6沉默后细胞的粘附能力显著增强。为了验证SIRT6去乙酰化酶活性与肿瘤迁移和侵袭之间的联系。同样地,我们进行Transwell迁移和侵袭实验,结果显示SIRT6的表达恢复挽救了SIRT6表达下调引起的细胞迁移及侵袭能力的增强,而SIRT6Y257F的表达恢复却不能挽救SIRT6表达下调引起的细胞迁移及侵袭能力的增强。这些结果表明,SIRT6抑制肿瘤细胞迁移和侵袭能力依赖其去乙酰化酶活性。3.SIRT6抑制沃伯格效应依赖其去乙酰化活性因为肿瘤的增殖和转移往往与其细胞代谢的紊乱密切相关。我们首先利用一种葡萄糖的荧光替代物2-NBDG在SIRT6表达敲低的细胞中进行葡萄糖摄取能力的检测,免疫荧光实验和流式细胞术实验结果显示,SIRT6表达敲低后肿瘤细胞对葡萄糖摄取能力显著增强;除此之外,我们利用化学检测方法分别检测了葡萄糖消耗量、乳酸产生量及乳酸脱氢酶LDH的活性,结果也显示在SIRT6表达降低的细胞中葡萄糖消耗量和乳酸产生量明显增多,且LDH活性也明显增强;利用RT-PCR检测糖酵解中关键基因的表达量,结果显示糖酵解关键基因如glut1、glut4、hk1、hk2、hk3、gapdh、pfk1、pkm2、ldh-a1和ldh-a2的表达量明显升高。为了进一步验证SIRT6去乙酰化酶活性与沃伯格效应的关系,我们在SIRT6表达下调的细胞中恢复SIRT6及SIRT6Y257F的表达。结果显示,SIRT6表达的恢复挽救了SIRT6表达下调引起的肿瘤细胞葡萄糖摄取能力的增强,同时挽救了葡萄糖消耗量和乳酸产生量的增多以及LDH活性的增强。除此之外,SIRT6表达恢复后糖酵解关键基因的表达量也明显增高。然而,SIRT6去乙酰化失活体SIRT6Y257F的恢复却不能挽救SIRT6下调引起的葡萄糖摄取能力的增强、葡萄糖消耗量的增多、乳酸产生量的增多、LDH活性的增强,以及糖酵解关键基因表达量的增高。这些结果显示,SIRT6抑制沃伯格效应依赖其去乙酰化活性。4.SIRT6转录调控CDK4和CCND1的表达因为近年来研究发现CDK4-CCND1蛋白复合体在糖代谢的调节中起着关键的作用。为了验证SIRT6是否与CDK4-CCND1有关,我们利用Western Blot检测了CDK4及CCND1的表达,结果显示SIRT6敲低后,CDK4及CCND1的表达显著下调;除此之外,糖酵解相关蛋白GLUT1、PKM2及GAPDH的表达却显著上升。为了进一步验证CDK4-CCND1是否为SIRT6的下游,我们在SIRT6过表达的细胞中敲低CDK4及CCND1,结果显示,CDK4及CCND1的敲低能够上调GLUT1、PKM2及GAPDH的表达,而对SIRT6的表达没有影响。进一步地,我们利用在SIRT6过表达的细胞中下调CDK4及CCND1的表达,结果显示CDK4及CCND1的敲低能够逆转SIRT6引起的糖酵解的降低。利用CDK4的抑制剂PD0332991处理SIRT6过表达的细胞,发现PD0332991消除了SIRT6引起的葡萄糖吸收的降低、葡萄糖消耗量的减少、乳酸产生量的减少、LDH活性的降低以及糖酵解相关基因表达的降低。这些结果表明CDK4及CCND1是SIRT6的下游。为了进一步验证SIRT6是如何调控CDK4及CCND1的表达的。我们首先在CDK4和CCND1的E-box区域和外显子区域设计引物,利用染色质免疫沉淀技术检测SIRT6是否结合到CDK4和CCND1启动子区域。结果显示,SIRT6能够富集到CDK4和CCND1的E-box区域。进一步地,我们利用双荧光素酶报告系统进一步验证SIRT6对CDK4和CCND1启动子E-box的调节,结果显示,SIRT6下调引起CDK4和CCND1启动子E-box区域活性降低,而对E-box区域外的启动子序列的活性没有调节能力。以上实验结果表明SIRT6能够结合到CDK4及CCND1启动子E-box序列,从而转录调控其表达。5.SIRT6直接结合CDK4-CCND1复合体并将CDK4去乙酰化文献报道SIRT6可能与CCNDBP1直接结合,然而并没有进一步验证。因为CCND1与CCNDBP1是直接结合的,因此我们猜想SIRT6可能与CDK4-CCND1有直接的相互作用。为了验证我们的猜想,我们进行了免疫共沉淀的研究。首先用SIRT6的抗体沉淀后,WB结果显示CDK4和CCND1都被共沉淀下来;反之,分别利用CDK4和CCND1的抗体反向沉淀后,WB结果显示SIRT6都被沉淀下来。为了进一步验证SIRT6去乙酰化功能如何通过直接结合来调控CDK4-CCND1的活性,我们首先查阅了CDK4和CCND1蛋白质序列上可能的乙酰化位点,结果显示在小鼠中只有CDK4第35位赖氨酸被乙酰化,而且该乙酰化位点被预测能够影响CDK4与ATP结合的效率。接下来,我们首先利用CDK4的抗体将CDK4沉淀下来,WB检测发现SIRT6敲低后CDK4乙酰化程度增高,而且恢复SIRT6表达后CDK4乙酰化降低下来,但是恢复SIRT6乙酰化活性突变体却不能降低CDK4乙酰化程度。进一步地将CDK4第35位赖氨酸突变为苏氨酸,构建出CDK4K35T突变体。在SIRT6敲低的细胞中过表达CDK4及CDK4K35T,结果显示CDK4过表达能够引起糖酵解关键蛋白GLUT1、PKM2、GAPDH等表达降低、葡萄糖吸收能力的减弱、葡萄糖消耗量的减少、乳酸生成量的减少、LDH活性的减弱、以及糖酵解相关基因表达的降低。而过表达CDK4K35T却进一步引起肿瘤细胞中沃伯格效应的减弱。以上结果表明,SIRT6能够将CDK4第35位赖氨酸去乙酰化,从而抑制了沃伯格效应。