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蛋白聚糖（Proteoglycan,PGs）是一类特殊的糖蛋白,有一条或多条糖胺聚糖链（glycosaminoglycans,GAGs）和一个核心蛋白共价链接形成的生物大分子。Glypicans（GPCs）是蛋白聚糖的一个重要家族,通过糖磷脂酰肌醇（Glycophosphatidylinositol,GPI）锚定于细胞表面,该家族主要有6个成员分别为GPC1-GPC6,其中Glypican-3（GPC3）是家族中的一员。GPC3是一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖HSPGs,由580个氨基酸组成大小为70 kDa的核心蛋白和两条连接在C端附近HS侧链组成。GPC3在肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）、肺鳞癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤和儿童胚胎肿瘤等多种肿瘤中均有表达,其中,在HCC表达尤其高。并且无论是从分子机制的角度,还是临床样本研究结果来看,GPC3都已成为HCC诊断和治疗的新型专一性生物标志物。目前,国内外针对于以GPC3为靶点的HCC临床诊断进行了大量的研究,并取得了一系列重要的研究成果。其中传统夹心ELISA方法由于操作简单、无需昂贵配套设备、易于普及推广等优点,被广泛应用于病人血清中GPC3的检测,但是该方法存在检测的灵敏度低,结果重现性差和耗时等弊端,特别是在HCC早期阶段,血清中GPC3的含量极低,且血清中含有大量的血浆蛋白、多肽、GAGs及核酸等生物大分子极易与GPC3结合,从而严重干扰GPC3的检测,使传统夹心ELISA法在以GPC3为标志物的HCC早期临床诊断应用过程中遇到了极大的困难。因此,急需对GPC3酶联免疫检测方法进行改进。根据GPC3结构,位于其核心蛋白羧基端的两条聚阴离子HS侧链的存在不仅可以与多种蛋白等生物大分子结合,而且还会干扰抗体与核心蛋白的识别。我们推测HS多糖链的存在,可能是导致传统ELISA方法检测GPC3耗时、灵敏度低及结果重现性差的主要原因。因此,在本研究中我们提出首先利用糖胺聚糖降解酶将GPC3核心蛋白羧基端HS侧链专一性降解去除,从而使核心蛋白上的抗体结合位点暴露,以提高传统ELISA在检测GPC3时的灵敏度、稳定性及速度,解决该方法在HCC临床诊断应用中面临的难题。本论文的主要研究结果如下:1.分泌型GPC3的表达和纯化:将本实验室前期研究中获得删除GPI结合位点可以分泌到细胞外的GPC3（GPC3ΔGPI）的全长基因构建至pTracer真核表达载体中,并转染HEK293T细胞,于37℃、5%CO2条件下培养细胞并收集培养上清液,利用DEAE Sepharose Fast Flow凝胶层析从细胞培养上清中纯化得到GPC3,并通过Western-blot进行检测并定量,结果显示纯化得到的GPC3与文献上报道相一致。2.GPC3抗体的制备及效价测定:（1）单克隆抗体的制备:将实验室已有的两株能够产生特异性识别GPC3氨基端抗体（αGCN）和羧基端抗体（αGCC）的单克隆细胞株分别接种到Balb/c小鼠腹腔中,形成腹水瘤,并收集腹水,利用Protein G/A亲和层析纯化相应单克隆抗体。SDS-PAGE分析显示,纯化后的单克隆抗体在还原条件电泳,分离为重链（55 kDa）和轻链（25 kDa）,表明两种单克隆抗体αGCN和αGCC都具有良好的纯度。（2）骆驼多克隆抗体的制备:利用纯化的抗原CPC3N充分乳化后对骆驼进行免疫,利用间接ELISA的方法对骆驼的抗血清进行效价测定,结果显示:效价可以达10,000以上;（3）兔多克隆抗体的制备:利用纯化的抗原GPC3△GPI充分乳化后对兔子进行免疫,经过效价测定:1号新西兰大白兔的血清的效价均可达到10,000,2号新西兰大白兔的血清效价达到20,000。3.GPC3酶联免疫检测方法的改进:将纯化的GPC3用不同种类的糖胺聚糖降解酶在30℃处理30 min,然后利用双抗夹心ELISA方法进行检测,实验结果显示:经过Hepase和EnCHase共同作用后GPC3的检测效果最好。进一步对该方法中的各个条件进行优化:（1）选择捕获抗体和检测抗体,分别使用单克隆抗体αGCN和αGCC作为捕获抗体进行铺板,并用骆驼多克隆抗体或兔多克隆抗体进行抗原检测,最终确定捕获抗体为单克隆抗体αGCN、检测抗体骆驼多克隆抗体。（2）确定捕获抗体的包被量:配制不同浓度的αGCN溶液,50 μl/孔过夜铺板,然后按照夹心ELISA方法进行检测,根据吸光度值的差别及本底值的高低选择抗体的包被量为0.25 μg/孔。（3）封闭液的筛选:用含有不同浓度的BSA或脱脂奶粉的缓冲液及含有5%蔗糖或乳糖的不同浓度的BSA或脱脂奶粉的缓冲液作为封闭液,按照筛选出的其它最适条件进行GPC3检测。结果表明,含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液是最佳封闭液。（4）抗原稀释缓冲液的筛选:将GPC3溶于不同pH的10 mM的NaAc-HAc、NaH2PO4-Na2HPO4、Tris-HCl的缓冲液中,并加入糖胺聚糖降解酶于30℃反应30 min,在其它最适条件下对GPC3进行检测,结果表明在pH 5.0NaAc-HAc的缓冲液中GPC3检测的效果最好;然后配制含有不同浓度NaCl的pH 5.0 NaAc-HAc的缓冲液,按照前面的方法进行GPC3检测,结果表明最适缓冲液为含有100 mMNaCl pH 5.0NaAc-HAc。（5）抗原孵育时间的确定:将糖胺聚糖降解酶处理后的抗原分别与捕获抗体反应不同的时间（0.5、1.0、2.0、3.0、和4.0 h）,其它分析步骤同上。结果表明,抗原的最佳孵育时间为室温下1h。（6）检测抗体稀释倍数的确定:用含有1%脱脂奶粉的PBS缓冲液将骆驼多克隆抗体进行浓度梯度稀释,在其它优化条件下对GPC3进行检测。结果表明,骆驼多克隆抗体的最佳稀释倍数为在1%脱脂奶粉的PBS缓冲液中稀释2,000倍。（7）酶标抗体稀释倍数的确定:用含有1%脱脂奶粉的PBS缓冲液将酶标抗体进行浓度梯度稀释,然后在其它优化条件下对GPC3进行检测。结果表明,酶标抗体的最佳稀释条件是含有1%脱脂奶粉的PBS缓冲液中稀释50,000倍。（8）含抗原血清的预处理:实验发现将含有GPC3的血清样本稀释后置于40℃条件下预处理30 min,能够显著提高检测的灵敏度。通过以上对夹心ELISA方法的改进及条件优化,血清中GPC3检测灵敏度由原来的ng级提升到pg级,且用时从原先的9～10小时缩短到5小时且检测结果的稳定性得到显著提高。4.改进GPC3酶联免疫检测方法的应用:为了验证改进夹心ELISA方法在检测实际HCC病人血清中GPC3时的可行性,我们将血清样本于40℃条件先进行预处理30 min后,加入糖胺聚糖降解酶后于30℃条件下进一步进行反应30 min,然后按照改进后的夹心ELISA检测方法进行检测,实验结果表明:临床样本中阳性检出率由原来的56%提高到现在的61%。与传统的酶联免疫检测方法相比,改进后的GPC3酶联免疫检测方法,操作简单、检测时长明显缩短、灵敏度高、特异性好、肝细胞癌患者的阳性检出率高,在HCC的早期诊断中具有重要的应用价值,为临床应用奠定了基础。