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目的从噬菌体抗体库中筛选获得的肝癌细胞HepG2特异性结合单链抗体(single chain Fv, scFv),为进一步提高其亲合力(avidity),构建和表达与肝癌细胞HepG2特异结合的双价抗体(Bivalent single chain Fv, BsFv),鉴定其生物学活性,并和亲本单链抗体进行比较。方法①以与肝癌细胞特异结合的单链抗体SLH10基因为模板,设计引物引入中间连接肽(G4S)及酶切位点AscI,通过PCR方法扩增出两个scFv片段,将其连接,并克隆至原核表达载体pAB1;②将表达载体转化大肠杆菌TG1,挑取单克隆细菌进行扩增,提取质粒酶切、测序鉴定;③阳性菌于23℃经IPTG诱导表达,在不同时间点收集菌液进行SDS-PAGE分析,并进行亚细胞定位分析,确定最适表达条件后进行大量表达,Ni2+-NTA层析柱纯化抗体,对纯化产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定;④通过FCM测定纯化产物与L02细胞和HepG2细胞结合活性,并进一步测定与其他几种肿瘤细胞株结合特性,比较BsFv、亲本scFv亲合力。结果①提取重组菌质粒,酶切经凝胶电泳可见约1500bp大小片段条带,与BsFv基因大小相符;测序结果提示两个扩增基因片段以及中间连接肽序列正确无误,表明BsFv构建成功;②scFv及BsFv表达菌于23℃经IPTG诱导随时间的延长，蛋白产量上升;收集处理诱导12h菌体，亚细胞定位分析提示细菌外周质中存在目的蛋白表达，分子量大小分别为30kD、60kD左右，与理论值相符;③经IPTG诱导大量表达，收集上清超滤浓缩，收集菌体经处理得到外周质产物，所有产物经NiZ+一NTA层析柱纯化，并通过SDS一PAGE分析、W己stem blot鉴定表明表达蛋白的分子量与理论值一致;④FCM分析纯化抗体分别与几种细胞株的结合活性，结果表明BsFv与亲本scFv比较，与HePGZ细胞结合率增加，与L02细胞及其他肿瘤细胞株结合率下降，表明BsFv与HePGZ细胞株亲合力有所增加。结论成功构建与表达双价抗体BsFv;与亲本抗体scFv比较，BsFv与细胞结合的亲合力增加，本实验为进一步将其作为肿瘤靶向分子研究奠定了基础。