研究背景：脑缺血诱导的神经元损伤及炎症是缺血后病变的主要特点。小胶质细胞是脑内主要的炎症细胞,小胶质细胞激活对于缺血后炎症进程以及慢性神经功能恢复有重要的影响。半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes, CysLTs)是一类重要的炎症介质,在脑缺血、脑外伤等中枢神经系统损伤性疾病发病中起重要作用。CysLTs主要通过半胱氨酰白三烯受体(cysteinyl leukotriene receptor, CysLT受体)起作用,主要包括CysLT,和CysLT2受体两种亚型。CysLT1和CysLT2受体广泛表达于全身；CysLT1受体在脑内表达较少,而CysLT2受体在脑组织表达相对较多。药理学研究提示,CysLT1受体参与脑缺血后急性神经元损伤和慢性胶质增生过程；CysLT1受体可通过增加血脑屏障通透性而参与缺血后炎症,并能介导粘附因子ICAM-1表达。大鼠局灶性脑缺血后,CysLT2受体mRNA表达上调；然而,因缺乏CysLT2受体选择性拮抗剂和动物特异性抗体,CysLT2受体是否参与脑缺血损伤以及对缺血后小胶质细胞的激活的调节作用,尚待阐明。研究目的：本文拟观察CysLT2受体对脑缺血缺血诱导的神经元损伤及小胶质细胞激活的影响,做以下3个方面的研究：(1)制备大鼠特异性多克隆抗体,观察大鼠局灶性脑缺血后脑内CysLT2受体表达的时空特征及细胞定位；(2)以RNA干扰技术,研究CysLT2受体对OGD诱导的皮层细胞混合培养中神经元损伤和小胶质细胞激活的影响；(3)观察CysLT2受体介导小胶质细胞激活和吞噬功能的调节。研究方法：以KLH偶联的大鼠CysLT2受体多肽免疫家兔制备抗体。以线栓法制备左侧大脑中动脉阻塞(MCAo),诱导大鼠局灶性脑缺血模型。以免疫组织化学及免疫印迹方法,观察CysLT2受体蛋白的时空表达特点,免疫荧光共染色观察受体在脑内的细胞分布。在大鼠皮层细胞混合培养或小胶质细胞培养中,以缺氧缺糖(OGD)诱导缺血性损伤；或以不同浓度激动剂LTD4处理细胞。以慢病毒shRNA靶向沉默CysLT2受体表达,观察RNA干扰对OGD诱导的原代皮层细胞混合培养神经元损伤和小胶质细胞激活的影响。观察CysLT2受体shRNA和CysLT受体拮抗剂对原代培养的小胶质细胞激活及吞噬的影响。研究结果：第一部分大鼠局灶性脑缺血后脑内半胱氨酰白三烯受体CysLT2受体表达的时空特征及细胞定位成功制备了抗大鼠CysLT2受体的多克隆抗体,ELISA及抗体中和试验证实其有高特异性。用此抗体进行Western blot实验,结果表明,大鼠MCAo后缺血中心区CysLT2受体蛋白在缺血再灌注6、12、24h和14d表达上调；缺血周边区,再灌注7d内CysLT2受体蛋白表达变化不大,而在再灌注14、28d明显增高。与Western blot结果相一致,免疫组织化学结果显示CysLT2受体阳性细胞数在缺血后中心区和周边区增多。免疫荧光共染色结果显示,正常大鼠脑组织中,CysLT2受体主要表达于脑室周围和皮层的星形胶质细胞中。大鼠MCAo后,在缺血中心区,再灌注24h后CysLT2受体主要表达于神经元,少量表达于星形胶质细胞和小胶质细胞,再灌注14d CysLT2受体主要表达于增生的小胶质细胞；在缺血周边区,再灌注14d后CysLT2受体主要表达于增生的星形胶质细胞,少量表达于小胶质细胞,而不表达于神经元。这些结果提示,CysLT2受体可介导脑缺血急性期神经元损伤、缺血后期星形胶质细胞增生和小胶质细胞炎症。第二部分CysLT2受体干扰对OGD诱导的皮层细胞混合培养中神经元损伤和小胶质细胞激活的影响大鼠原代皮层细胞混合培养中,经RT-PCR及免疫荧光证实,慢病毒shRNA成功抑制CysLT2受体表达。OGD/R (OGD1h,恢复24h)或LTD4诱导LDH释放,PI/Hoechest33342染色结果显示细胞坏死和凋亡增加。CysLT2shRNA或CysLT受体非选择性拮抗剂BAY u9773,抑制OGD/R或LTD4诱导的LDH的释放,减少细胞坏死数目,而凋亡没有明显变化。细胞免疫荧光染色结果显示,CysLT2shRNA抑制小胶质细胞激活的形态变化；免疫荧光共染色结果显示,细胞死亡以神经元死亡为主,星形胶质细胞和小胶质细胞死亡很少,CysLT2受体shRNA减少神经元死亡。上述结果提示,CysLT2受体介导皮层细胞混合培养中OGD诱导的神经元损伤和小胶质细胞激活。第三部分CysLT2受体介导小胶质细胞激活和吞噬功能的调节原代培养的大鼠小胶质细胞中,免疫荧光染色显示,静息状态下CysLT1和CysLT2受体表达较少,OGD/R (OGD1h,恢复24h)诱导CysLT1和CysLT2表达上调。CysLT2受体shRNA抑制CysLT2受体蛋白表达,却上调CysLT1受体表达。CysLT2受体shRNA和CysLT受体拮抗剂BAY u9773,抑制OGD和LTD4诱导的小胶质细胞激活和吞噬；而CysLT1受体选择性拮抗剂普鲁斯特显著增加小胶质细胞的吞噬。 CysLT2受体选择性激动剂N-甲基白三烯N-methyl leukotriene C4, NMLTC4激活小胶质细胞的吞噬,BAY u9773抑制这种作用,而普鲁斯特没有影响。这些结果提示,CysLT2受体调节小胶质细胞激活和吞噬功能；CysLT1受体介导小胶质细胞吞噬的抑制；并且,CysLT1和CysLT2两种受体亚型间可能存在相互调节。结论：1.在大鼠局灶性脑缺血后,脑内CysLT2受体表达的时间过程和空间分布特点表明,CysLT2受体介导缺血后急性神经元损伤以及后期小胶质细胞激活,并参与调节后期星形胶质细胞增生及胶质疤痕形成过程。2.在大鼠皮层细胞混合培养中,CysLT2受体shRNA和拮抗剂的结果表明,CysLT2受体介导OGD诱导的神经元损伤和小胶质细胞激活。3.在大鼠原代小胶质细胞,OGD诱导CysLT1和CysLT2受体表达上调；shRNA及拮抗剂结果表明,CysLT2受体介导OGD诱导的小胶质细胞的激活和吞噬；拮抗剂结果表明,CysLT1受体介导小胶质细胞吞噬的抑制；干扰CysLT2受体表达可上调CysLT1受体表达,且提示两种受体间存在相互调节,共同参与调节小胶质细胞功能。