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基于分泌型高斯荧光素酶的HIV-1中和活性测定方法的建立与评价诱发机体产生能够中和全球不同的HIV-1分离株的广谱中和抗体是HIV-1疫苗研究的关键,同时也需要标准化且高通量的检测方法能够准确测定在天然HIV-1感染期间或者通过疫苗引起的中和抗体应答的效力和广度。现在最常用的是基于HIV-1 Env-假病毒和TZM-bl细胞的中和检测方法。TZM-bl是HeLa细胞衍生物,能在细胞表面高表达CD4,CCR5和CXCR4,易于HIV/SIV感染,并含有Tat反应性报告基因:萤火虫荧光素酶基因和大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因。TZM-bl细胞更容易被多种HIV-1毒株感染,并且可以产生比外周血单核细胞(PBMC)更能重复的结果。凭借其灵敏,准确和高通量的优点,该检测方法已被广泛用于测量HIV-1感染个体,人类疫苗试验和接种疫苗动物血清中的中和活性。以TZM-bl细胞和PBMCs为基础的两种中和检测实验,在比较两种方法的检测结果上基本保持一致,然而基因工程改造后的TZM-bl细胞会表达高水平的CCR5和CXCR4,这使得TZM-bl细胞对HIV-1病毒的感染更敏感,并且可能无法完全反映自然感染过程的中和效力。基于体外PBMC的中和检测实验被认为是最接近生理条件下的中和反应,然而PBMC的中和检测实验步骤比较复杂,价格昂贵且低通量检测的缺点,此外不同供体的PBMC对HIV病毒感染的敏感性不同而且供体的PBMC的差异容易使结果发生变异,这些缺点都大大限制了PBMC在中和检测实验中的应用。只有当活病毒或Env-假型病毒用于感染PBMC或其他没有工程化报告基因的细胞时,必须使用昂贵的p24或RT检测来确定感染。为了解决这个问题,含有报告基因(荧光素酶或人胎盘碱性磷酸酶)的HIV-1骨架基因组被用于测定在没有报告基因的细胞中病毒的复制和中和活性。由于操作比较繁琐,未感染的对照细胞背景较高,所以它们还没有广泛用于测定中和活性。与人源化的萤火虫荧光素酶(FLuc),海肾荧光素酶(RLuc)和vargula荧光素酶(VLuc)高相比,人源化Gaussia荧光素酶可以在实验动物体内的活细胞中产生超过1000倍的生物发光信号,并且在体外的发光信号比活细胞要高100多倍。还有文献报道Gaussia荧光素酶被设计到流感病毒基因组中并用于检测活动物和细胞培养物中的感染位点以及测定中和活性。在本实验中,我们通过将Gaussia荧光素酶基因克隆到SG3Δenv基因组中来产生新的病毒骨架与HIV-1 Env克隆产生的假病毒,去感染TZM-bl细胞和T细胞系,结果显示病毒的感染情况可以通过检测细胞培养上清中的荧光素酶活性,同时该检测系统可以应用于任何HIV能够感染的细胞。接下来我们将Gaussia检测系统应用到HIV中和活性检测实验中,通过检测HIV病人血清中的中活性,得到的中和滴度与常用的TZM-bl假病毒中和检测结果相比显示没有统计学差异。同时反应该策略用于检测滴度较低的中和抗体具有很好的敏感性,并且该方法同样易于检测在HIV-1感染个体,人类疫苗试验和接种疫苗动物血清中的中和活性。