目的：　　PKCδ(Protein kinase Cδ，PKCδ)在细胞的生长、分化、凋亡、肿瘤进展中发挥非常重要的作用，但目前关于PKCδ在信号转导中的具体作用还不十分清楚，关于PKCδ的激酶生理性作用底物方面的研究也甚少。本研究小组前期工作首次发现BAG3是PKCδ的磷酸化底物。　　BAG(Bcl-2 associated athanogene，BAG)家族是20世纪90年代初新发现的细胞凋亡调控蛋白家族，其成员可以通过“BAG”功能区与热休克蛋白(Heat-shockprotein，Hsp)家族成员结合。BAG3是BAG家族成员之一，与热休克蛋白Hsp70/Hsc70具有高度亲和力，通过作用于Hsp70/Hsc70产生非常广泛的细胞生物学效应，如抑制细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖和转移等。BAG3虽然本身的抗凋亡作用有限，但它能与抗凋亡蛋白Bcl-2结合并发挥协同作用，拮抗bax和Fas/FasL介导的细胞凋亡作用。BAG3还可以直接与粘着斑激酶(Focal adhesion kinase，FAK)相互作用，调控肿瘤细胞粘着和迁移;并且BAG3的表达水平与多种肿瘤细胞的转移及侵袭关系密切。另外，BAG3还能与磷脂酶C(Phospholipase Cγ，PLCγ)特异结合，在表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）受体酪氨酸激酶信号转导复合物被激活后，BAG3与PLCγ解离，激活Hsp70/Hsc70，参与EGF信号转导的调控。BAG3在大部分正常人体组织中表达很弱或不表达，但在白血病细胞和许多实体肿瘤中表达明显增加，BAG3的高水平表达维持肿瘤细胞的存活，抑制BAG3的表达可以明显增加肿瘤细胞对TRAIL、蛋白酶体抑制剂等化疗药物的反应性。这些研究表明，BAG3通过与Bcl-2、Hsp70、PLCγ、 FAK等多种蛋白相互作用，在多个水平调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、运动、迁移及侵袭等行为，与肿瘤的发生、发展及对化疗药物敏感性关系密切。　　翻译后修饰使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一，是基本生命活动完成的必须条件。其中，磷酸化是最普遍的翻译后修饰方式之一。有研究表明BAG3蛋白在细胞内保持基础水平的磷酸化状态，在基础条件下BAG3与PLCγ、 Hsp70/Hsc70相互作用，形成三元复合物。表皮生长因子信号促进BAG3与PLCγ解离，同时激活Hsp70/Hsc70，增加PLCγ和BAG3蛋白磷酸化水平;而广谱PKC抑制剂可以降低BAG3基础水平磷酸化，并且可以抑制EGF诱导的BAG3与PLCγ的解离。PLCγ是磷脂酶C家族的一个重要成员，在许多肿瘤组织和肿瘤细胞系中PLCγ的表达升高，并且与肿瘤的增殖、迁移、运动及侵袭等行为关系密切。表皮生长因子作为其上游信号分子，通过磷酸化PLCγ参与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等行为的调节。这些结果表明BAG3蛋白可被磷酸化修饰，并且BAG3的磷酸化修饰可能通过调控EGF介导的PLCγ活化，参与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等行为的调节。然而执行BAG3磷酸化的具体激酶、磷酸化的具体作用靶点及其功能尚不清楚。前期工作中我们鉴定出BAG3是PKCδ的磷酸化底物，提示PKCδ信号转导通路可能通过磷酸化BAG3，进而调节其生物学功能。　　本研究拟论证PKCδ介导BAG3蛋白磷酸化对肿瘤细胞运动、迁移和侵袭等生物学行为的影响及其潜在的分子机制。通过本项目的进一步深入解析，将加深我们对BAG3上游调控信号以及PKCδ生理性激酶作用底物的理解，加深我们对BAG3及PKCδ在肿瘤发生、进展以及耐药等方面机制的理解，对于寻找新的药物作用靶点和肿瘤标志物都具有非常积极的意义和重要参考价值。　　方法：　　1、培养CHO细胞，建立WT-PKCδ、DN-PKCδ、CA-PKCδ稳定过表达CHO细胞系;培养甲状腺癌FRO细胞，建立WT-BAG3、S187A-BAG3、S187D-BAG3稳定过表达FRO细胞系。　　2、应用磷酸化蛋白宫集、二维差异凝胶电泳和质谱分析技术确定PKCδ的底物，并通过Western blot和免疫共沉淀确定PKCδ和BAG3之间的相互作用。体外激酶实验确定BAG3蛋白的磷酸化位点。　　3、相差显微镜观察细胞形态变化并成像，对比各组稳定转染细胞系细胞形态的区别。鬼笔环肽对细胞骨架染色后，荧光显微镜观察细胞形态变化并成像，应用专业软件测定细胞长轴、短轴直径后计算其比值，对细胞形态的变化进行定量分析。　　4、应用Real-time PCR、Western blot、免疫荧光技术检测各稳定转染FRO细胞系中EMT标记物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin的表达量及表达位置变化。　　5、划痕修复实验、transwell转移小室、三维Matrigel转移小室实验观察各稳定转染FRO细胞系中细胞迁移、侵袭能力的变化。　　6、应用PKCδ特定激活剂、抑制剂处理WT-BAG3稳定转染FRO细胞系，观察肿瘤细胞侵袭的变化，以探讨其可能的机制。　　结果：　　1、BAG3是PKCδ的磷酸化底物之一，两者之间存在一定的相互作用，PKCδ在Ser187位点磷酸化BAG3。　　2、BAG3蛋白Ser187位点磷酸化影响细胞形态，模拟磷酸化S187D-BAG3稳定过表达FRO细胞变得狭长，呈纺锤状，细胞连接变得松散，形态更趋于间质细胞;阻碍磷酸化S187A-BAG3稳定过表达FRO细胞变得立方，细胞连接紧密，形态趋于上皮细胞。　　3、BAG3蛋白Ser187位点磷酸化状态影响FRO细胞EMT标志物的表达量，S187D-BAG3稳定过表达FRO细胞间质细胞标志物N-cadherin和波形蛋白表达水平提高，上皮细胞标记物E-cadherin表达水平下降。S187A-BAG3稳定过表达FRO细胞间质细胞标记物N-cadherin和波形蛋白表达水平较低，而上皮细胞标记物E-cadherin的表达水平较高。　　4、BAG3蛋白Ser187位点磷酸化导致FRO细胞EMT标志物的表达位置变化，免疫荧光结果显示S187D-BAG3稳定过表达FRO细胞中E-cadherin的表达出现了向核周的内化，在WT-BAG3和S187D-BAG3稳定过表达FRO细胞中可见β-catenin的表达提高并且向细胞内发生了重新分布，尤其在S187D-BAG3稳定转染FRO细胞β-catenin主要表达在核周。　　5、BAG3蛋白Ser187位点磷酸化影响FRO细胞的迁移侵袭，坐标定点划痕修复实验显示WT-BAG3稳定转染FRO细胞运动能力提高，S187D-BAG3稳定转染FRO细胞迁移能力进一步提高，转移小室实验同样显示WT-BAG3和S187D-BAG3稳定转染FRO细胞迁移能力显著提高。　　结论：　　1、BAG3是PKCδ的磷酸化底物之一， PKCδ在Ser187位点磷酸化BAG3。　　2、BAG3蛋白Ser187位点磷酸化导致FRO细胞形态改变，促进FRO细胞发生EMT表型转换。　　3、BAG3蛋白Ser187位点磷酸化介导EMT，提高FRO细胞的迁移、侵袭能力。