目前全球有2.8亿糖尿病患者,发病率逐年升高,并且表现出年轻化趋势,其中90%是2型糖尿病(Type2diabetes mellitus, T2DM),仅美国就有2800万2型糖尿病患者,占到总人口7%。在2007年糖尿病死亡率位列第七位。目前研究认为2型糖尿病的发病是多因素的结果,尤其是以遗传及不良生活习惯为主,而内科相关治疗手段,如增加运动量、限制食物摄取、使用降糖药物及胰岛素等,均不能使其根除。由于需要长期坚持治疗甚至维持终生,患者依从性差,使血糖水平不能维持在正常水平范围之内,导致各种并发症的发生。2型糖尿病长期血糖控制不佳除了引起失明、肾病、神经系统疾病及孕期并发症外,还要面对持续高发的由于心肌梗死导致的充血性心力衰竭和死亡,而扩张性心肌病的发病率越来越高,有研究表明大约有60%的2型糖尿病患者表现心肌收缩功能的失调。糖尿病患者消耗大量公共医疗资源,医疗费用是正常非糖尿病患者的两到三倍。美国每年为糖尿病患者投入1740亿美元,预计到2020年要增加到1920亿美元,其中67%直接与糖尿病相关。因此,寻找安全、长效、依从性高的治疗方法成为全球关注的热点,而关于2型糖尿病相关治疗机制值得深入探讨。减肥手术(Bariatric surgery)作为研究热点,有越来越多的研究针对各种手术方式、短期或长期的葡萄糖稳态的改善而进行。目前研究认为,减肥手术后患者通过能量摄入减少及胰岛素相关胃肠道激素的分泌变化而改善血糖内稳态,最终起到血糖控制的作用。回肠转位术(Ileal transposition, IT)的理念首次在1982年被Koopmans HS等人在肥胖动物实验模型中提出。而此术式首先在非肥胖型2型糖尿病大鼠中与其他术式(如胃旁路术,胆胰转流术等)相比有效的缩短了手术操作以及术后恢复时间。另外,血糖控制改善常常发生于体重明显减轻之前,预示手术在2型糖尿病改善中的直接作用,而不是继发于体重减轻和肥胖消除。这些发现揭示了远端回肠内分泌激素机制可能参与了术后非肥胖2型糖尿病的恢复。同时,胰高血糖素样肽(Glucagon-like peptide-1, GLP-1)作为有效的胰岛素释放促进剂,已经被实验证实可以促进正常和缺血再灌注后心脏的葡萄糖摄取。回肠转位术延迟了近端肠管与摄入食物的接触而促进回肠与食物接触,保持了肠管的完整性,促进GLP-1的分泌,越来越多的实验证据为回肠转位术在促进2型糖尿病心肌胰岛素信号通路及葡萄糖转运改善方面提供可能。为研究回肠转位术对心肌糖代谢功能、胰岛素信号通路及葡萄糖转运可能的作用及机制,本课题采用自发性非肥胖2型糖尿病Goto-Kakizaki (GK)大鼠为动物模型,首先确定GK大鼠在心肌糖代谢、胰岛素信号及葡萄糖转运方面的变化,行回肠转位术并监测术后系统性血糖内稳态、胰岛β细胞功能及胃肠道激素等变化,然后进一步研究心肌葡萄糖摄取及胰岛素信号通路重要蛋白,并行体外心肌细胞培养,以期为手术治疗2型糖尿病改善心血管并发症提供理论支持及治疗依据。第一部分非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢及胰岛素信号变化非肥胖2型糖尿病GK大鼠作为自发性糖尿病大鼠模型,表现轻度血糖升高,葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能受损,明显的葡萄糖不耐受,外周胰岛素抵抗,这些都可能导致心肌受损。我们首先验证了GK大鼠心肌葡萄糖摄取功能,胰岛素信号及葡萄糖转运的变化。1. GK大鼠心肌胰岛素刺激的葡萄糖摄取显著低于对照鼠为研究心脏葡萄糖摄取的情况,我们收集各30只,8-10周龄GK大鼠及其对照大鼠Sprague-Dawley (SD)大鼠的新鲜心脏,首先进行心脏Langendorff灌注清洗残余血迹,然后在含有2D-3H-glucose的Krebs-Ringer’s缓冲液中孵育一段时间后,加入胰岛素或者对照试剂刺激,最终检测心肌的葡萄糖摄取量。结果显示在没有胰岛素刺激(对照试剂)的情况下,GK大鼠心肌细胞的葡萄糖摄取与对照组无异；但是胰岛素刺激可以大大促进大鼠心肌的葡萄糖摄取,而GK大鼠心肌葡萄糖摄取量明显低于对照组。提示GK大鼠心肌葡萄糖摄取功能受损。2.GK大鼠心肌胰岛素信号通路变化胰岛素与胰岛素受体(Insulin Receptor, IR)的结合可以引起胰岛素信号通路一些列酪氨酸残基的自身磷酸化,这些磷酸化的酪氨酸残基可以被其衔接蛋白的Protein Tyrosine Binding domain (PTB)结构域识别,这其中以胰岛素受体底物(Insulin Receptor Substrate, IRS)蛋白为代表,这个过程引起了IRS蛋白重要酪氨酸残基的磷酸化,从而导致被Phosphoinositide3-kinases (PI3K)等脂质激酶激活而结合。本研究着重于此信号通路的重要蛋白的mRNA及总蛋白表达,各自的磷酸化及IRS-1结合的PI3K。我们收集胰岛素或者葡萄糖刺激的GK大鼠及SD大鼠的新鲜心脏,提取总mRNA及蛋白质,利用RT-PCR、免疫印迹(Western blot)及免疫共沉淀法(Co-immunoprecipitation, Co-IP)检测IR-β、IRS-1及其酪氨酸磷酸化、Akt (Protein Kinase B)总蛋白和磷酸化蛋白,以及胰岛素刺激的IRS-1结合的PI3K蛋白总量的表达。2.1胰岛素受体β (IR-β) mRNA、总蛋白及其磷酸化蛋白表达降低胰岛素受体作为跨膜的大分子蛋白,分为α、β两个亚基,胰岛素信号通路的激活,首先需要与α亚基结合而发生构型变化,导致跨膜的β亚基酪氨酸磷酸化,从而引起下游一系列信号的激活。故IR-β的总量与其磷酸化在胰岛素信号通路中起重要作用。本研究通过RT-PCR、Western blot及免疫共沉淀等试验证实在GK大鼠心脏中IR-βmRNA、蛋白总量及酪氨酸磷酸化降低,提示其心肌胰岛素受体水平的降低,从而预示心肌胰岛素信号可能存在受损情况。2.2胰岛素受体底物-1(IRS-1) mRNA、总蛋白及其磷酸化蛋白表达降低胰岛素受体底物也与胰岛素受体后水平的调节有关,其中IRS-1主要作用于横纹肌(骨骼肌、心肌),而IRS-2则广泛作用于肝脏、脂肪及骨骼肌等。有研究证实在IRS-1-/-动物模型中,动物出现严重的胰岛素外周抵抗,证实IRS-1在胰岛素信号通路中的作用。本研究通过RT-PCR、Western blot及Co-IP等试验证实在GK大鼠心脏中胰岛素受体底物rnRNA.蛋白总量及酪氨酸磷酸化降低。胰岛素受体后水平的降低,提示心肌胰岛素受体酪氨酸激酶活化后的环节障碍。2.3胰岛素刺激的IRS-1/PI3K/Akt蛋白信号通路抑制IRS-1与PI3K蛋白的结合是胰岛素发生代谢作用的主要途径。而胰岛素受体/IRS/PI3K信号通路障碍,势必引起下游代谢受影响。本研究通过新鲜心脏组织Co-IP实验证实GK大鼠心脏中IRS-1/PI3K结合明显降低,提示心肌胰岛素代谢作用受损。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,又被称蛋白激酶B (PKB)。作为IRS/PI3K信号通路F游的靶蛋白,其主要通过激活细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)来诱导细胞周期进展；对于细胞葡萄糖摄取方面,其通过增加葡萄糖转运因子4(GLUT4)的活性来实现,最终促进细胞生长；Akt活化后还可磷酸化糖原合成激酶3(GSK3)促进糖原合成,并可增加细胞无氧糖酵解水平。其对胰岛素葡萄糖代谢起着重要作用,其磷酸化水平与其活性密切相关。本研究通过RT-PCR、Western blot及Co-IP等实验证实在GK大鼠心脏中Akt蛋白总量未变,而酪氨酸磷酸化降低,Akt活性的降低提示IRS/PI3K下游通路受损。3.GK大鼠葡萄糖转运蛋白表达变化葡萄糖转运蛋白是细胞转运葡萄糖的载体,其中葡萄糖转运蛋白-1(GLUT1)广泛的表达于各种组织,可以调节葡萄糖的摄取并且具有较强的亲和力；而GLUT4主要表达与脂肪组织和横纹肌中(主要有心肌和骨骼肌),在胰岛素刺激的情况下,能够有效的将葡萄糖及自身从细胞浆转运到细胞膜上,从而促进胰岛素刺激的葡萄糖转运。有研究表明在Akt及PI3K都可以促进GLUT4的易位。为进一步研究GK大鼠葡糖糖代谢通路的变化,本研究收集大鼠的新鲜心肌,提取组织总mRNA、总蛋白及膜蛋白,采用RT-PCR、 Western blot方法,检测葡萄糖转运蛋白1及葡萄糖转运蛋白4的表达。结果证实葡萄糖转运蛋白1及葡萄糖转运蛋白4蛋白表达总量与对照鼠一致,而葡萄糖转运蛋白4膜蛋白表达量明显低于对照组SD大鼠,提示GK大鼠心肌葡萄糖转运能力下降。第二部分回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠血糖稳态及心肌葡萄糖糖摄取作用回肠转位术是将远端10cm回肠切除并吻合到近端空肠,人为复制如Roux-en-Y胃旁路术(RYGB)和胆胰转流术(Biliopancreatic diversion, BPD)手术后未消化的食糜提前到达接触远端回肠模型。此手术模型不会引起明显的营养不良或胃容量限制而引起研究者的兴趣。有研究显示,回肠转位术可以明显促进链脲佐菌素诱导SD糖尿病大鼠的胰岛素分泌,并且显著增加血清肠内分泌激素,如GLP-1、多肽YY激素(PYY)等浓度；也有试验显示回肠转位术后早期(10-45天)非肥胖型糖尿病大鼠胰岛素抵抗得到改善。为验证远端回肠在早期及长期葡萄糖耐受、血糖内稳态及胰岛β细胞功能改善方面是否起作用,并且与动物摄食及体重的改变的关系；同时,为探索回肠转位术在心肌葡萄糖摄取的作用,本研究采用非肥胖2型糖尿病GK大鼠进行回肠转位术并进行一系列相关指标的探索。1.动物模型的评价雄性8-10周龄GK大鼠及相应同龄SD大鼠,术前常规检测进食量、体重、空腹血糖浓度,评估糖尿病模型及对照组的稳定性,其中空腹血糖≥7.0mmol／L,2h血糖≥11.1mmol/L的GK大鼠分为糖尿病手术组与糖尿病假手术组,SD大鼠皆为非糖尿病对照组。1.1术前手术组与假手术组评价常规术前检测糖尿病手术组与糖尿病假手术组食物摄取、体重、空腹血糖浓度、口服糖耐量实验(OGTT)、胰岛素抵抗(ITT),同时监测胰岛素β细胞功能(餐前后血清胰岛素、葡萄糖刺激的C肽)、胃肠内分泌激素(GLP-1、 GIP、PYY)分泌量,发现术前手术组与假手术组皆没有明显差异。1.2术后手术组与假手术组评价1.2.1各组动物手术评价常规记录手术时间及成功率,观察并严格记录术后并发症及恢复情况。两组动物平均手术时间及术后恢复时间无明显差异,手术成功率100%,其中手术组及假手术组各死亡2只,死亡率6.7%,死亡原因分别为术后肠梗阻及吻合口漏。该研究证明回肠转位术与假手术相比,术式安全可靠。1.2.2回肠转位术对动物进食、体重、空腹血糖、口服糖耐量及胰岛素抵抗的影响术后常规多个时间点记录动物食物摄取量,体重及空腹血糖浓度并行口服糖耐最实验和胰岛索抵抗实验。结果显示,术后动物摄食量第4周与假手术组出现明显差异,体重在第8周出现差异。而血糖及糖耐量、胰岛素抵抗改善都早于摄食和体重的改变,提示手术对于葡萄糖内稳态的改善作用可能不依赖于体重和摄食量的变化。同时,通过6个月的检测,手术组血糖维持稳定,有显著改善,故回肠转位术对血糖的改善是长期(6个月)而稳定的。1.2.3回肠转位术对胰岛p细胞功能影响胰岛p细胞功能是指胰岛β细胞在葡萄糖的刺激下,分泌胰岛素以保持稳定的机体血糖水平的功能。测定胰岛p细胞功能手段之一是测量血清胰岛素含量和C肽水平。为了证实回肠转位术在胰岛素p细胞功能改善的作用,收集大鼠空腹或者胃灌注葡萄糖后血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中胰岛素及C肽水平。结果证实,回肠转位术能够促进血清胰岛素及C肽分泌,改善胰岛β细胞功能。1.2.4回肠转位术对胃肠激素分泌影响为了研究回肠转位术对胃肠激素分泌的影响,本研究测定大鼠血清样本中GLP-1、PYY及GIP的含量。有研究证实,胃旁路手术后血清GLP-1、PYY持续性明显增加,而在动物实验中,GLP-1已经被证实能促进胰岛素分泌,增加胰岛β细胞的增殖和抑制其凋亡。GLP-1通过直接与胰岛p细胞的受体直接结合而起作用；另有人体实验证据表明,减肥手术后GLP-1的升高能引起较长期的高胰岛素低血糖状态；而关于PYY的动物减肥手术研究也证实其可以促进胰岛β细胞功能的增强。GIP又称为葡萄糖依赖性胰岛素释放肽,是一个42个氨基酸的多肽,主要由十二指肠和空肠黏膜细胞分泌。在高血糖状况下其可以促进胰岛β细胞分泌胰岛素,目前关于其在肥胖和2型糖尿病减肥手术的生理功能研究不足。通过对照研究,发现术后血清GLP-1,PYY明显较假手术组升高,但是GIP的分泌区别不大,预示GIP可能不是减肥手术后血糖稳定改善的因素之一。2.回肠转位术对动物心肌细胞葡萄糖摄取的影响葡萄糖摄取的作为血糖内稳态的重要指标。本研究采用术后离体新鲜大鼠心脏,灌注后胰岛素刺激葡萄糖摄取,结果显示术后短期葡萄糖摄取没有明显改善,而术后6个月对比手术组与假手术组,心肌细胞葡萄糖摄取功能明显恢复。并且提示,回肠转位术可能促进心肌胰岛素信号及葡萄糖转运功能。第三部分回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢改善机制研究前期研究证明非肥胖2型糖尿病大鼠心肌胰岛素信号机葡萄糖转运受损,而多篇文献报道回肠转位术在改善血糖内稳态的作用,然而机制并未阐明。本研究第二部分研究发现回肠转位术改善动物整体及心肌细胞的糖代谢,促进胰岛p细胞功能改善及胃肠激素分泌,为了进一步阐明该手术对非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢改善的机制,本部分首先利用大鼠新鲜心脏及骨骼肌,采用Western blot及免疫沉淀等分子生物学技术,对胰岛素信号通路及葡萄糖转运蛋白进行研究。同时,本部分分离非肥胖2型糖尿病GK大鼠心肌细胞进行培养,行体外实验,并使用GLP-1及其受体激动剂Ex-4刺激培养细胞,探索GLP-1在心肌胰岛素信号及葡萄糖转运代谢中可能存在的作用机制,为药物及手术治疗糖尿病提供可能的思路及理论支持。1.回肠转位术对心肌胰岛素信号的影响1.1胰岛素受体-p(IR-β)及其磷酸化蛋白表达增加术后6个月回肠转位术组大鼠心脏IR-β明显增加,并且磷酸化IR-β蛋白表达量与IR-β蛋白总量变化趋势相同,表明磷酸化蛋白增加可能与IR-β蛋白总量增加呈正相关,提示术后大鼠心肌胰岛素信号存在改善1.2胰岛素受体底物-1(IRS-1)及其磷酸化蛋白表达增加IRS-1及其磷酸化早在术后1个月即发生明显变化,而术后6个月回肠转位术手术组与假手术组中蛋白表达总量区别更明显。1.3胰岛素刺激的IRS-1/PI3K蛋白信号通路改善IRS-1结合的P13K活性增加被认为是胰岛素抵抗改善的重要指标之一。我们采用免疫共沉淀法检测IRS-1结合的PI3K活性表达,通过对比术后1个月及6个月IRS一1结合的PI3K蛋白表达量,发现术后1个月其表达量就有增加,而术后6个月IRS-1结合的PI3K增加更明显,而术后1个月与6个月相比差别有统计学意义(p<0.05)。2.回肠转位术对心肌及骨骼肌细胞葡萄糖转运蛋白的影响本课题测定骨骼肌及心肌组织中GLUT4,总蛋白及细胞膜含量的表达。所有分组总GLUT4表达量未见明显区别。术后1个月细胞膜蛋白GLUT4表达量增加,而6个月后增加量更加明显。3.GLP-1及其受体激动剂在GK大鼠体外心肌细胞培养中胰岛素样作用通过离体心肌细胞培养以及对照研究实验,我们发现GLP-1及其受体激动剂Ex-4都存在拟胰岛素样作用,其可以促进葡萄糖摄取及IRS-1结合的PI3K活性增加。本研究从而通过体外实验,证明第二部分中回肠转位术增加的血清GLP-1的分泌,而血清GLP-1增加又能促进心肌细胞的胰岛素信号通路改善和葡萄糖代谢摄取增加,从而正向促进GK大鼠整体及心肌胰岛素信号及葡萄糖转运的改善。