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酮病是危害高产奶牛产后健康的最常见疾病之一,研究该病血浆和乳清中酮体水平与lept in. Insulin.氧化／抗氧化的关系对深入了解该病发病机理具有重要意义。本实验测定了乳清抗氧化指标总抗氧化(TAC),丙二醛(MDA),过氧化氢酶(CAT),谷胱甘肽过氧化物酶(GPX),NEFA(NEFA)和Insulin、leptin、Insulin样生长因子等内分泌因子,按照酮体含量区分健康牛和酮病牛,分析了乳清中酮体和抗氧化指标的相关性以及激素的表达量。本研究利用放射免疫分析(Radio Immuno Assay, RIA)和荧光定量PCR技术以及奶牛肝细胞体外原代分离培养,通过添加不同浓度的leptin、Insulin、Insulin样生长因子,检测犊牛肝细胞氧化应激状态相关指标CAT、GPX活性和mRNA表达量、TAC浓度、MDA含量。为了更深入了解奶牛酮病的发病机理,以便为更好地制定防治措施提供理论依据。实验包括实验一：为了探讨荷斯坦奶牛乳汁酮体含量与部分氧化／抗氧化指标水平的相关性,本研究选择广西某奶牛场泌乳早期的荷斯坦奶牛98头,乳清指标检测结果：乳清KET、TAC、MDA、GPX和CAT水平分别为13.8±6.7mg/dl.5.0±3.1 U/ml、2.2±1.8 nmol/ml、56.1±47.1 U/ml和3.0±2.0U/ml。高乳酮(乳酮≥20 mg/d1,n=18)组奶牛各项指标(除CAT外)的水平均高于中(乳酮10～19.9 mg/d1,n=47)、低乳酮组(乳酮<10 mg/d1,n=33)的水平,各组KET间存在极显著差异,中、低乳酮组的TAC间差异显著。相关性分析发现全部被检牛KET与TAC间(r=0.237)、TAC与MDA间(r=-0.233)存在显著相关性。高乳酮组MDA与TAC(r=-0.586)、MDA与KET(r=-0.482)存在显著负相关(p<0.05),对照组(乳酮<20mg/dl)TAC与KET间存在极显著正相关(r=0.298,n=80,p<0.01)。结论：研究获得了奶牛乳清酮体和部分氧化／抗氧化指标的测定值。高乳酮对奶牛乳清氧化／抗氧化指标间的相关性会产生明显影响,使TAC与KET相关性变弱,使MDA与TAC负相关性显著增强,使KET与MDA由显著的正相关变为显著负相关。实验二：为探讨酮病奶牛产后乳清和血浆的leptin, Insul in,NEFA的水平及其关系,实验选取健康奶牛7头和酮病奶牛7头,自产后第2周开始到7周,每周采集血样和乳样,检测奶牛乳清和血浆的leptin.Insulin和NEFA的水平。结果表明：酮病牛血浆和乳清leptin,Insulin的水平都降低,而NEFA浓度升高。奶牛乳清NEFA、Insulin、leptin水平显著比血浆水平高。血浆和乳清水平间均有显著相关性,NEFA(n=84,r=0.810,P=0.001), lept in(n=84, r=0.64, P=0.025), Insul in(n=84,r=-0.627,P=0.029)。结论,发现了酮病奶牛血浆和乳清leptin,Insulin, NEFA的特征,乳清NEFA的检测具有替代血浆检测的可能性。实验三：本研究通过体外培养犊牛新生肝细胞,测定不同浓度的leptin.Insulin和Insulin样生长因子对肝细胞中抗氧化关键酶表达量的影响。在细胞培养中添加添力口leptin(0、2.5、5、10、50禾口100 ng/ml) Insulin(0.5.10.20.50和100 nM)；Insulin样生长因子(0、10、30、50、100和150 ng/ml)培养24 h后,同时在培养液中检测抗氧化的指标(MDA,TAC,GPX,CAT)前后添加leptin、Insulin和IGFI。结果表明CAT、GPx、β-actin的SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR扩增效率均为100%,标准曲线方程和回归系数分别为y=-3.315x+14.72,R2=0.9992；y=-3.228x+8.78,R2=0.9998；y=-0.301x+8.9344,R2=0.9997。荧光定量PCR溶解曲线为单一峰,特异性强,无引物二聚体。结论：高浓度Insulin和Insulin growth factor 1能增加肝细胞氧化酶CAT,GPX的活性和mRNA表达水平。