论文部分内容阅读
盐碱土壤在世界范围内广泛分布,是影响农作物产量的重要非生物胁迫因素之一,同时盐碱环境也自然筛选出一些耐盐碱植物,如碱蓬属(Suaeda)植物。盐地碱蓬(Suaedasalsa(L.) Pall.)是一种典型的盐生植物,对盐碱具有高度适应性。本研究从盐地碱蓬中克隆了3个耐盐碱相关基因SsCMBL、 SsDUF760和SsCaS,并对它们在植物耐盐碱胁迫反应过程中的功能进行了研究。 核苷酸序列的生物信息学分析表明,SsCMBL基因编码区cDNA序列全长933 bp,其基因组DNA序列全长1377 bp,由3个外显子和2个内含子组成。SsCMBL编码一个有310个氨基酸残基的蛋白质分子,含有3个保守的结构域,即PLN02341结构域,CLP-蛋白酶结构域和自水解酶-4结构域。SsDUF760基因编码区cDNA序列全长1197 bp,基因组DNA序列全长2963 bp,有6个外显子和5个内含子。SsDUF760编码398个氨基酸残基,蛋白分子中含有两个保守的DUF760结构域。SsCaS基因编码区cDNA序列全长1191 bp,基因组DNA序列全长4816 bp,包含6个外显子和5个内含子。SsCaS编码一个由396个氨基酸残基组成的蛋白质分子,含有一个RHOD保守结构域。 利用TAIL-PCR方法从盐地碱蓬基因组DNA中分别克隆了SsCMBL、SsDUF760和SsCaS基因的启动子序列,分别长1976 bp、2307 bp和1886 bp。序列分析发现,3个基因的启动子区都含有与非生物胁迫和与植物激素相关的顺式作用元件。 表达谱分析表明,SsCMBL基因在花中表达量较高,在根、茎和叶中的表达量较低。该基因受Na2CO3和NaCl胁迫诱导上调表达,也受植物激素茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)诱导上调表达。SsDUF760基因在叶和花中表达量较高,在茎和根中的表达量较低。该基因受Na2CO3胁迫和MeJA诱导上调表达,受脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)诱导下调表达。SsCaS基因在叶中表达量最高,在茎和花中次之,在根中的表达量最低。该基因受Na2CO3和NaCl胁迫诱导下调表达,而受植物激素ABA、SA、GA和MeJA诱导上调表达。 利用GUS报告基因和拟南芥转基因系,研究了SsCMBL、SsDUF760和SsCaS启动子序列的活性。GUS组织染色结果表明,在正常生长条件下,SsCMBL和SsDUF760的启动子能启动GUS基因在植物的根、真叶、雌蕊的柱头、长角果的顶部和基部微弱表达;SsCaS的启动子能启动GUS基因在植物的根、子叶、真叶、雌蕊的柱头、雄蕊的花丝、长角果的顶部和基部表达,但在根中表达较少。Na2CO3和NaCl胁迫能增强SsCMBL、SsDUF760和SsCaS基因启动子的活性。 利用拟南芥原生质体进行亚细胞定位实验结果显示,SsDUF760定位于叶绿体;SsCMBL和SsCaS定位于细胞质。系统进化分析表明,SsCMBL、SsDUF760和SsCaS与同属藜科的甜菜中的同源蛋白亲缘关系最近。 利用转基因拟南芥研究了盐地碱蓬基因SsCMBL、SsDUF760和SsCaS的耐盐碱功能。结果表明,过表达SsCMBL和SsDUF760基因的拟南芥植株的耐盐碱胁迫能力显著提高。具体表现为,在Na2CO3和NaCl胁迫条件下,过表达SsCMBL和SsDUF760基因的拟南芥植株的种子萌发率(3-4天)、根长(7天)、地上部分生物量和莲座叶的叶绿素含量显著提高,而丙二醛(MDA)含量显著降低,植株的生长状态明显好于野生型对照。由此证明SsCMBL和SsDUF760基因具有提高拟南芥对盐碱胁迫耐受性的功能。过表达SsCaS基因的拟南芥只有个别株系(OE3)显著提高了对Na2CO3胁迫的耐受能力,但对NaCl胁迫没有明显反应。 利用基因枪法分别将盐地碱蓬基因SsCMBL、SsDUF760和SsCaS转入了优良小麦品种科农199中,获得了T1代转基因小麦种子,为研究SsCMBL、SsDUF760和SsCaS基因在小麦中的耐盐碱功能和评价其育种应用价值奠定了基础。