论文部分内容阅读
萜类化合物是结构与种类最为丰富的植物次生代谢产物,通过萜类合成酶(Terpenesynthase,简称TPS)催化形成。不同种类的柑橘果实在萜类芳香物质组分方面存在巨大差异,可能是造成不同柑橘具有特征香味的主要原因。佛手(C.medica L.var.sarcodactylis Hort)是构橼的变种,具有独特的芳香。目前,佛手区别于其他柑橘果实的芳香物质组分尚不清楚,它们在发育中花、叶和果实等器官发育过程中的分布与变化规律、合成相关的TPS及转录调控网络研究也较少。本研究以’青衣童子’佛手为对象,利用代谢组、转录组和分子生物学等技术开展了相关研究,主要结果如下:1.利用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合气相质谱联用(GC-MS)技术从佛手中鉴别出了 62种芳香物质。芳香物质以单萜类最为丰富,约占芳香物质总量的64.82%-90.97%。含量最高的芳香物质是柠檬烯,分别占成熟叶片和果实芳香物质总量的41.79%和58.36%。佛手芳香物质的总含量随着花、叶和果实发育呈现增加的趋势。成熟果实的芳香物质含量最高(26.95 mg/g),约为花苞组织的4倍。维恩图分析显示33种芳香物质可以同时在花、叶和果实中检测到。采用最小偏二乘法(PLS)计算发现了 24种物质的变量重要性投影值(VIP)大于1的芳香物质,它们在区分佛手不同器官中具有重要作用。进一步鉴别出了区别于宽皮柑橘、杂柑、甜橙和酸橙等果实的6种芳香物质,认为它们是佛手果实的特征芳香组分。2.基于代谢组和转录组学结果开展了加权共表达网络分析(WGCNA),鉴别出了萜类芳香物质合成相关的TPS和转录因子。本研究以枸橼(C.medica)基因组为对照对佛手进行转录组测序获得了 32579个基因,鉴别出了 58个TPS基因家族成员,主要包括亚家族a、b、e/f和g。佛手TPS基因家族成员中的16个主要在花中表达,25个主要在叶片中表达,17个主要在果实中表达。同时,鉴别出了NAC、MYB、WRKY、bHLH、AP2/ERF和bZIP等转录因子的基因家族成员,并明确了它们在佛手不同器官和发育过程中的表达模式。WGCNA显示同萜类芳香合成有关的基因主要富集在模块Red和模块Green,进一步挖掘出了3个TPS和5个转录因子,它们可能同佛手果实的萜类芳香物质形成有关。3.结合芳香物质含量和基因表达模式,并利用体外重组蛋白和体内同源瞬时表达分析技术,鉴别出了参与佛手芳香物质双环牛儿烯合成的TPS基因CmTPS1。克隆得到了佛手的一个TPS基因家族成员CmTPS1,该基因序列长度为1668 bp,属于TPS-a亚家族。基于烟草瞬时表达体系分析结果,CmTPSl定位于细胞质。在佛手不同器官及发育过程中,CmTPS1表达水平与芳香物质双环牻牛儿烯含量具有正相关性。利用原核表达系统获得的CmTPSl重组蛋白能够利用法尼基焦磷酸(FPP)作为底物,在30℃条件下催化多种倍半萜形成,其中双环牻牛儿烯为主要产物。CmTPSl并不能以拢牛儿基二磷酸(GPP)为底物合成萜类芳香物质。在佛手叶片组织中开展瞬时过量表达分析,结果显示增加CmTPS1表达促进了芳香物质双环牻牛儿烯的积累。