背景：　　蛋白质是参与生命活动的重要物质，维持蛋白质合成与降解的动态平衡是一切生命保持正常生理功能的必要条件。细胞内蛋白质的降解有两条途径，即溶酶体途径和泛素-蛋白酶体途径。其中泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是真核细胞、古细菌和其他一些细菌胞内降解蛋白质的通路之一。在真核细胞的细胞核和细胞浆中，80％以上的蛋白质，包括调控细胞周期、细胞程序性死亡以及感染等重要信号途径的调节蛋白均受此途径的降解调控。蛋白酶体的主要功能是蛋白质水解作用降解不需要的和损伤的蛋白质，其生化本质就是通过水解蛋白质的肽键，把大分子的蛋白质水解为短肽片段，进而影响细胞的增殖、分化、凋亡、DNA复制和修复、转录和蛋白质控制等。该通路的功能改变会引起蛋白质降解的异常，进而导致细胞功能的异常。人体的许多疾病如肿瘤、神经系统疾病等的发生与UPP功能异常密切相关，因此UPP已经成为多种疾病治疗的新靶标。研究和开发干扰该途径的药物,为多种疾病的治疗提供了新的治疗策略。　　目前抗肿瘤的主要策略包括烷化剂、抗代谢物和细胞毒药物，以及与有丝分裂、拓扑异构酶和酪氨酸激酶相关的抑制剂。金属配合物在药物设计和肿瘤治疗中展现了独特的性质，顺铂及其类似物作为睾丸癌和卵巢癌最有效的化疗药物应用于临床一线。但是其存在的毒性也促使新的高效低毒的药物的开发。Q.Ping Dou等人报道铜的配合物具有抑制细胞26S蛋白酶体的功能，为蛋白酶体抑制剂的开发开辟了新途径。　　研究目的：　　本研究前期实验表明吡硫翁铜（Copper Pyrithione,CuPT）对细胞上26S蛋白酶体有明显的活性，对纯化的20S蛋白酶体则没有抑制效应，提示CuPT可能作用于19S进而影响26S蛋白酶体活性的。进一步的研究表明CuPT对19S RP去泛素化酶USP14、Uch-L5和Rpn11(POH1)具有抑制效应。因此如果将去泛素化酶CuPT和20S蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib,Velcade)联合应用将对肿瘤细胞的泛素-蛋白酶体通路起到双重抑制的效应，从发挥更好的抗肿瘤效应。　　实验方法：　　1、细胞活力测定：采用MTS法检测去泛素化酶抑制剂CuPT联合20S蛋白酶体抑制剂万珂（Velcade,Vel）对肿瘤细胞活力的影响。　　2、细胞死亡检测：采用AnnexinV-FITC/PI双染荧光显微镜观察并拍照记录CuPT联合Velcade（Vel）对细胞的形态学变化；同时用流式细胞仪分析细胞死亡情况。　　3、裸鼠载体实验：NCI-H929接种裸鼠两侧腋下，CuPT2.5mg.kg-1腹腔注射观察并记录给药组和对照组裸鼠体重和肿瘤体积的变化，并在适当的时候取材。　　4、特定蛋白检测：采用 Western bolt检测CuPT联合 Velcade对蛋白酶体系统内源性泛素化蛋白（Ub-proteins,Ub-pros.），泛素-蛋白酶体通路底物蛋白c-Jun、IκBα，细胞凋亡相关蛋白p27、Bax、pro-Caspase3、pro-Caspase8、pro-Caspase9及PARP的影响。　　结果：　　（一）CuPT与Velcade联合对肿瘤细胞的毒性、蛋白酶体泛素化底物及细胞死亡相关蛋白的变化　　1.CuPT与Velcade联合对人骨髓瘤细胞 U266和人骨髓瘤NCI-H929的增值抑制效应　　1.1细胞活力变化不同浓度的CuPT（12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM和400nM）与不同浓度的 Velcade（10nM、15nM、20nM、25nM和30nM）联合作用于人骨髓瘤细胞U266和人骨髓瘤细胞NCI-H929细胞株24小时和48小时后MTS法检测细胞活力明显下降，作用优于CuPT和Velcade的单独用药组，联合指数小于1，表明 CuPT对 Velcade有增敏效应，并且这种效应存在剂量依赖。　　1.2细胞死亡变化不同浓度的CuPT（25nM、50nM和100nM）与20nM的Velcade联合作用于人骨髓瘤细胞NCI-H929细胞株18小时，AnnexinV-FITC/PI双染荧光显微镜观察发现CuPT与Velcade联合用药组细胞死亡明显多于CuPT单独用药组。流式细胞术结果显示CuPT单独用药组的细胞死亡率18小时分别为4%、4.3%和3.7%；CuPT与 Velcade联合用药组细胞死亡率18小时分别为34.5%、32.4%和30.7%。并且CuPT与Velcade联合用药组的细胞死亡以晚期凋亡和坏死为主。　　（二）细胞泛素化底物以及死亡相关蛋白的变化　　1.CuPT以及CuPT与Velcade联合对人骨髓瘤细胞U266细胞株泛素化底物以及死亡相关蛋白的调节　　不同浓度的CuPT（50nM、100nM、200nM和400nM）单独用药以及它们与20nM的Velcade联合作用于人骨髓瘤细胞 U26618小时，Western Blot结果显示不同浓度的CuPT单独给药时泛素化底物增加不明显，只在400nM是有少许泛素化底物蛋白增加，而联合用药组泛素化底物蛋白明显优于CuPT单药组；而且K48-联接的多聚泛素化底物要明显多于K63-联接的多聚泛素化底物；同时CuPT400 nM以及CuPT和Velcade联合用药组均能增加泛素-蛋白酶体通路底物蛋白c-Jun。　　2.CuPT以及CuPT与Velcade联合对人骨髓瘤细胞NCI-H929泛素化底物以及死亡相关蛋白的调节　　不同浓度的CuPT（50nM、100nM和200nM）单独用药以及它们与20nM的Velcade联合作用于人骨髓瘤细胞NCI-H929细胞株18小时，Western Blot结果显示联合用药组能显著增加泛素化底物，诱导pro-caspase3/8/9的减少，PARP裂解，转录因子c-Jun、CDI p27KIP1、促凋亡蛋白Bax增加，介导肿瘤细胞死亡。　　3.CuPT以及CuPT与 Velcade联合对人肝癌细胞 Hep G224小时泛素化底物以及死亡相关蛋白的调节　　不同浓度的CuPT（50nM、100nM和200nM）单独用药以及它们与20nM的Velcade联合作用于人肝癌细胞Hep G224小时，Western Blot结果显示Velcade组与联合用药组泛素化底物显著增加，CDI p27KIP1、促凋亡蛋白Bax增加，PARP裂解。　　（三）BSO和NAC对CuPT引发的总的泛素化底物以及 K48位联接泛素化底物和K63联接的泛素化底物的影响　　不同浓度的CuPT(0.25μM,0.5μM和0.75μM)作用两小时后，分别加入100μM的 BSO和100μM的NAC。其中BSO可以增强CuPT的效应，而NAC则可以逆转CuPT的效应。　　（四）CuPT对BALB/c裸鼠异种移植瘤的影响　　1.CuPT2.5mg/kg给药五天，裸鼠体重的变化（图12.A）肿瘤组织（图12.B）以及对照组与用药组平均瘤重对比（图12.C），肿瘤生长抑制率为71.3%(p=0.001，<0.05)，两组之间存在显著性差异。　　2.CuPT对裸鼠模型肿瘤组织相关蛋白的影响：用药组较对照组泛素化底物蛋白增加，CDI p27KIP1、促凋亡蛋白Bax、核因子IκBα、泛素-蛋白酶体通路底物蛋白c-Jun增加，PARP裂解。　　结论：　　1．CuPT作为去泛素化酶的抑制剂具有引起内源性泛素化底物蛋白积累、诱导细胞凋亡的作用，在与20S蛋白酶体抑制剂Velcade联合应用时，通过抑制泛素-蛋白酶体通路中不同的酶（19S RP去泛素化酶和20SCP水解酶活性）从而显著增加肿瘤细胞死亡，增强Velcade的抗肿瘤效果；　　2．CuPT对荷瘤裸鼠的肿瘤生长具有显著抑制作用。