死亡时间(postmortem interval PMI),又称死后间隔时间,是指发现、检查尸体时距死亡发生时的时间间隔。死亡时间的准确推断,具有重要的法医学实践价值,一直是法医学研究中的一个重点和难点。死亡时间的推断有多种方法,传统主要是依据尸体现象(尸斑、尸冷、尸僵等)和胃内容物消化过程、尸体蝇蛆生长规律等,但这些方法比较粗略,并且受环境、地域的影响比较大。近年来随着分子生物学技术的发展,生物体内核酸物质在机体死后的时间依赖性降解规律逐渐被应用于死亡时间推断的研究。众多学者发现管家基因的降解变化与死亡时间之间存在良好的线性关系,适合用于死亡时间的推断研究。目前的研究集中在GAPDH和β-actin,但由于GAPDH和β-actin属于机体内高丰度mRNA,在早期死亡时间内变化曲线并不明显,更适合作内参。同时mRNA的降解也受环境因素的影响,这也是限制其应用于死亡时间推断研究的一个因素。我们通过前期实验研究发现微小RNA (microRNA)和18S核糖体RNA,在大鼠死亡后的不同阶段具有较好的稳定性和变化规律,更适合用于死亡时间的推断。本课题通过实验筛选出大鼠心肌细胞中受环境因素影响较小同时在机体死后具有一定降解规律的核酸物质,如miRNA和18S rRNA。固定外界环境温度及湿度,以大鼠心肌组织为研究对象,应用实时荧光定量PCR评价miRNA和18S rRNA在机体死后不同时间的变化规律,旨在为死亡时间推断研究提供新的手段及指标。第一部分大鼠死后不同死亡时间组织提取及心肌形态学鉴定目的获得大鼠死后不同时间的心肌组织,并观察不同死亡时间心肌形态学变化。方法固定外界环境温度及湿度,断颈处死大鼠,于死后不同时间解剖取心肌组织。福尔马林固定后切片进行HE染色。结果成功获得了大鼠死后不同时间的心肌组织。心肌HE染色结果显示,心肌自溶变化规律与传统尸体现象发生规律基本一致。24h开始有少量心肌细胞发生自溶,细胞破裂；96h大部分细胞发生自溶,细胞结构不清,核消失；144h后,横纹肌完全消失,心肌细胞核完全崩解、碎裂；168h后,无细胞形态,无细胞核。第二部分大鼠死后不同死亡时间组织RNA的提取及降解规律分析目的研究组织RNA的降解变化规律与死亡时间的相互关系。方法Trizol提取组织RNA, Nano Drop1000检测RNA抽提的浓度及纯度。非变性凝胶电泳观察不同死亡时间RNA的降解变化规律。结果28S条带随着死亡时间的延长呈现逐渐降解的趋势,至24h基本消失,5S条带变化不明显。48h后,RNA基本被降解为小片段。第三部分大鼠死后心肌组织中microRNA和18S rRNA的荧光定量分析目的研究大鼠心肌组织中microRNA和18S rRNA的变化规律与死亡时间的相互关系。方法实时荧光定量聚合酶链式反应法检测大鼠心肌细胞中microRNA和18S rRNA的含量水平。结果大鼠死后120h内心肌组织中miRNA(如miR-1-2)含量无明显变化,此后开始下降；而18S rRNA含量在96h内逐渐增多,随后开始缓慢下降。大鼠死后不同时间18S rRNA的Ct值以及18S rRNA和miR-1-2的ΔCt值与PMI呈非线性相关,回归方程分别为：Y1=0.0012X2-0.1759X+19.022(R2=0.9487)；Y2=-0.0006X2+0.1192X-0.1833(R2=0.8072)。第四部分已知死亡时间人体组织样本的初步实验验证分析目的初步验证已知确切死亡时间的人体心肌组织中microRNA和18S rRNA的含量水平与动物实验所得回归方程的契合度。方法实时荧光定量聚合酶链式反应法检测人体心肌细胞中microRNA和18S rRNA的含量水平,将结果代入回归方程比较推测值与实际值间的误差。结果人体心肌组织中microRNA和18S rRNA的含量较大鼠心肌组织丰富,根据回归方程推断的死亡时间与实际死亡时间基本吻合,误差在2小时左右。结论利用mRNA尤其是管家基因(如GAPDH和β-actin)的降解规律推断死亡时间是现阶段法医学研究的焦点。但是,由于如GAPDH和β-actin属于高丰度mRNA,在早期死亡时间内变化规律不明显,更适合在推断死亡时间时作为内参照。选择一个或多个指标综合判断PMI是突破传统死亡时间推断研究的关键。本实验研究发现miRNA和18SrRNA具有良好的稳定性和规律性,在法医学死亡时间推断中具有良好的应用价值。本实验采用ABI 7500 Fast Real-Time PCR仪进行相关研究,发现miRNA相对稳定。在机体死后120h内miRNA的含量保持在一个相对稳定的水平,不随死亡时间的变化而发生变化,在120h后它的含量开始下降。这是因为microRNA是一类非编码的单链小RNA,只有21～25个核苷酸,由于片段很小,在生物体内非常稳定。说明在早期死亡时间内,miRNA可以作为一个稳定的内参照指标客观反映其它生物指标的变化水平。因此,miRNA作为一种分子标志物由于其稳定性在死亡时间推断中具有非常重要的价值。本研究同时发现18S rRNA大鼠死亡后早期阶段含量逐渐增多,在96h左右达到峰值,随后又开始下降。分析认为18S rRNA在细胞中以单独形式存在的含量很少,大部分存在于由多个核糖体组成的复杂核糖体蛋白复合物中。这为18S rRNA提供了一个相对安全的环境,可以隔绝RNA酶和其他化学因素的影响,使18S rRNA保持稳定。随着死亡时间的延长,蛋白质降解,18S rRNA从复合物中释放出来,在死后一定时间内,含量逐渐增多,具有一定的规律性。这是由于在死后的96h内,18S rRNA的降解速度低于其从核糖体蛋白复合物中释放的速度；而96h之后,由于大部分18S rRNA已经释放,其降解速度开始超过释放速度,使96h之后的18S rRNA含量逐渐下降。本课题组认为,综合利用miRNA的稳定性和18S核糖体RNA的规律性进行死亡时间推断,比单独利用管家基因的半定量PCR的结果更加准确、可靠。由于尸体现象的发生和发展受到各种条件的制约,不管是利用DNA、RNA或是蛋白质的降解规律进行死亡时间推断都存在一定的缺陷和不足,一种指标和方法难以准确判断死亡时间。如何选择、优化不同指标并将这几种指标和方法进行综合应用,是今后利用生物大分子推断死亡时间的研究方向。本实验通过更为精确的Real-Time PCR方法发现18S rRNA的变化规律与死亡时间存在密切关系(Y=0.0012X2-0.1759X+19.022),miRNA在死后较长的时间内含量保持稳定。通过收集已知死亡时间的人体组织样本,进行初步实验验证分析后,得出的结果与实际死亡时间存在一定的误差,但误差在2h左右,证明microRNA和18S rRNA的变化规律能较为准确的进行死亡时间判断。