研究背景与目的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)作为全球发病率第三的恶性肿瘤,其发病率高、致死性强,每年新发病例100万,死亡近90万。生活水平的提高和生活方式的转变使得结直肠癌在发展中国家的发病率逐年上升,同时晚期患者的五年生存率也不理想。因此,进一步阐释CRC的发生发展机制是十分必要的,它可为提高CRC的诊断和治疗水平提供更多更准确的理论支持。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是肿瘤行为重要的决定因素,显著影响着肿瘤的进展、治疗效果和临床转归。巨噬细胞是浸润在TME中最主要的免疫细胞,可达肿瘤质量的50%并与肿瘤的不良预后相关。巨噬细胞具有可塑性,在TME成分的调控下通常极化为免疫抑制表型(M2型),再通过刺激新生血管生成和促进肿瘤生长、转移,从而加速肿瘤的进展。CRC具有相似的微环境,其中浸润的巨噬细胞数量增加,并与CRC的分期和淋巴转移相关。新生血管生成是影响肿瘤进展的一个重要因素,也是近年来肿瘤基础研究和临床治疗研究的一个重要关注点。TME中,参与促进新生血管生成的因子很多,包括血管内皮生长因子、血管生成素等多种生长因子和细胞因子;而巨噬细胞也具有诱导血管生成、增加血管密度的作用。但是,TME中的各种蛋白质分子、肿瘤细胞和巨噬细胞之间如何相互作用及其与新生血管生成、肿瘤生长和转移的关系尚未完全阐明。分泌型蛋白S100A6是S100家族的成员,在CRC等多种肿瘤中高表达,并与CRC的分期和淋巴转移相关。我们前期的研究发现,微环境中的S100A6既可直接促进CRC细胞增殖,也可通过激活巨噬细胞间接地促进CRC细胞增殖和迁移。基于上述,我们提出两个假设:1.S100A6参与调控巨噬细胞的招募和活化;2.S100A6通过招募、活化的巨噬细胞实现对新生血管生成以及CRC细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用。本课题以人单核细胞系THP-1、人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)以及人结直肠癌细胞系LoVo、SW480细胞系作为研究对象,探讨S100A6对巨噬细胞的招募和活化的影响及其机制;同时,进一步研究S100A6活化的巨噬细胞对新生血管生成和CRC细胞增殖、迁移能力的影响及其机制。方法1、重组蛋白GST-hS100A6和GST的制备及鉴定:重组蛋白经由大肠杆菌表达,分离纯化后通过SDS-PAGE和Western blot鉴定。2、人单核细胞系THP-1诱导为巨噬细胞:适当接种对数期生长THP-1细胞,加入佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA;终浓度为100ng/ml)诱导24h后,悬浮生长的细胞转变为贴壁生长、小圆形有伪足伸出的巨噬细胞。3、S100A6对巨噬细胞的招募和活化的影响及机制3.1 S100A6招募巨噬细胞的作用及机制3.1.1采用细胞迁移试验检测GST-hS100A6(终浓度为30μg/ml)处理后巨噬细胞迁移功能的变化。3.1.2应用Western blot检测GST-hS100A6处理后巨噬细胞中RGAE(receptor for advanced glycation end products)、JAK2、STAT3、p-JAK2(Tyr1007/1008)、p-STAT3(Tyr705)的蛋白质水平。3.1.3使用RAGE阻断剂FPS-ZM1和JAK2抑制剂XL019分别预处理巨噬细胞30min后,再用GST-hS100A6处理巨噬细胞,通过细胞迁移试验检测GST-hS100A6对巨噬细胞招募作用的影响。同时采用Western blot验证FPS-ZM1和XL019分别对RAGE或者JAK2/STAT3通路的抑制作用。3.2 S100A6活化巨噬细胞的作用3.2.1采用Q-PCR检测GST-hS100A6处理后的巨噬细胞的M2型标志物CD206、CD163、IL-10以及M1型标志物iNOS和TNF-α的mRNA水平。3.2.2使用细胞免疫荧光试验检测GST-hS100A6处理后巨噬细胞内M2型标志物CD206的蛋白水平。4、S100A6活化后的巨噬细胞对HUVEC细胞的血管形成能力、迁移能力和增殖能力的影响及机制4.1条件培养基制备:使用GST-hS100A6(终浓度为30μg/ml)处理巨噬细胞12h后,弃去培养基,PBS洗三遍,加入新鲜无血清培养基继续培养24h后收集培养基,1000rpm离心3min,4℃保存,即为条件培养基,简称A6-Mφ-CM。4.2采用体外血管形成试验检测A6-Mφ-CM对HUVEC细胞的血管形成能力的影响。4.3分别采用Q-PCR和Western blot检测GST-hS100A6处理后巨噬细胞中促血管形成因子VEGFA、IL-6和CCL2的m-RNA和蛋白质水平。4.4采用划痕试验和Transwell试验检测A6-Mφ-CM对HUVEC细胞迁移能力的影响。4.5采用MTT试验检测A6-Mφ-CM对HUVEC细胞增殖能力的影响。5、S100A6活化后的巨噬细胞对CRC细胞增殖、迁移和侵袭的作用及机制5.1采用MTT试验检测A6-Mφ-CM对CRC细胞增殖能力的作用。5.2采用Transwell试验检测A6-Mφ-CM对CRC细胞迁移和侵袭的作用。5.3采用Western blot检测CRC细胞内EMT相关蛋白E-cadherin和N-cadherin的蛋白质水平。6动物实验:为了验证体外实验的结果,包括S100A6招募巨噬细胞的作用以及对新生血管生成的影响,本研究使用表达S100A6的腺病毒(Ad-S100A6)和表达S100A6干扰siRNA的腺病毒(Adsi-S100A6)分别感染SW480细胞,从而过表达或下调S100A6;以2×10~6个细胞接种到裸鼠皮下成瘤。30d后取瘤,石蜡包埋,切片。使用免疫组织化学染色法(IHC)检测移植瘤组织中S100A6、巨噬细胞通用标志物CD68和微血管标志物CD31的表达水平。结果1、成功制备GST-hS100A6和GST重组蛋白。2、成功诱导THP-1为巨噬细胞。3、S100A6招募和活化巨噬细胞的作用及机制3.1体外细胞迁移试验发现GST-hS100A6处理组巨噬细胞迁移数目增加(p<0.01);动物实验获取的SW480细胞移植瘤IHC染色发现:过表达和下调S100A6表达组的移植瘤组织中CD68阳性染色强度分别相应地升高和降低。即体内和体外实验结果一致,均表明S100A6具有招募巨噬细胞的作用。3.2 GST-hS100A6处理后巨噬细胞的RGAE、JAK2、STAT3、p-JAK2(Tyr1007/1008)、p-STAT3(Tyr705)蛋白质水平均高于相应对照组(p值均小于0.05)。提示S100A6激活巨噬细胞的RAGE/JAK2/STAT3信号通路。3.3 FPS-ZM1和GST-hS100A6联合处理组的巨噬细胞迁移数目明显低于GST-hS100A6组(p<0.001);XL019和GST-hS100A6联合处理组的巨噬细胞迁移数目明显低于GST-hS100A6组(p<0.01),并且FPS-ZM1抑制GST-hS100A6对RAGE表达的上调以及JAK2/STAT3信号通路的激活,XL019抑制GST-hS100A6对JAK2/STAT3信号通路的激活。这些结果一致提示RAGE/JAK2/STAT3信号通路的激活参与介导S100A6对巨噬细胞的招募作用。3.4 GST-hS100A6组的M2型巨噬细胞标志物CD206、CD163、IL-10的mRNA水平高于相应对照组(p值均小于0.05),其M1型标志物iNOS和TNF-α的mRNA水平则与相应对照组没有明显差异(p值均大于0.05);同时,GST-hS100A6组的巨噬细胞CD206蛋白水平高于对照组。这些实验结果一致提示S100A6诱导巨噬细胞向M2型极化。4.S100A6活化后的巨噬细胞对HUVEC的血管形成能力、迁移能力和增殖能力的影响及机制4.1体外血管形成试验结果显示GST-hS100A6单独处理组没有明显的促进血管形成的作用(p>0.05),而A6-Mφ-CM组的血管分支和分支长度明显高于对照组(p<0.05)。提示S100A6活化的巨噬细胞具有促进血管生成的作用。同时,过表达和下调S100A6组的移植瘤组织中微血管标志物CD31阳性染色强度也分别高于和低于相应对照组,进一步证明微环境中S100A6的水平与血管形成能力密切相关。4.2 GST-hS100A6组巨噬细胞中的促血管形成因子VEGFA、IL-6、CCL2的m-RNA和蛋白质水平均高于相应对照组(p值均小于0.05)。提示S100A6诱导巨噬细胞分泌促血管形成因子。4.3 GST-hS100A6单独处理组没有明显促进HUVEC细胞迁移的作用(p>0.05),但A6-Mφ-CM组的划痕愈合率和穿过小室的细胞数均高于对照组(p<0.01)。提示S100A6活化的巨噬细胞可促进HUVEC细胞迁移。4.4 GST-hS100A6和A6-Mφ-CM对HUVEC细胞的增殖作用与各自对照组没有明显差异(p值均大于0.05)。5.S100A6处理后的巨噬细胞对CRC细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制5.1 A6-Mφ-CM组的LOVO和SW480细胞的迁移和侵袭能力明显高于相应对照组,p值均小于0.05;但它们的增殖能力与对照组相比没有明显变化。提示S100A6活化后的巨噬细胞具有促CRC细胞迁移和侵袭的作用。5.2 A6-Mφ-CM组的LOVO和SW480细胞中N-cadherin的蛋白水平高于相应对照组,而E-cadherin的蛋白水平则低于相应对照组。提示S100A6活化后的巨噬细胞具有诱导CRC细胞发生EMT的作用。本部分结果提示S100A6活化后的巨噬细胞具有促进CRC细胞迁移、侵袭和EMT的作用;其促EMT作用可能是其促迁移和侵袭的机制之一。结论1、S100A6具有招募巨噬细胞的作用,其机制涉及RAGE/JAK2/STAT3信号通路的激活。2、S100A6诱导巨噬细胞向M2型极化。3、S100A6无直接促进血管生成的作用;但可通过其活化的巨噬细胞间接促进血管生成,机制涉及S100A6诱导巨噬细胞分泌促血管生成因子CCL2、IL-6和VEGFA。4.S100A6具有经由巨噬细胞介导的间接促CRC迁移、侵袭和EMT的作用,其机制涉及巨噬细胞的活化。