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第一章FBXW7在上皮性卵巢癌和正常卵巢上皮细胞中的表达分析目的:明确FBXW7在上皮性卵巢癌组织和正常卵巢上皮组织中的表达情况方法:(1)依托隶属于NCBI(美国国立卫生研究院)的GEO(Gene Expression Omnibus,基因表达数据库),以“上皮性卵巢癌”为关键字搜索出编号为GDS3592上皮性卵巢癌表达谱,然后用其检测数据中FBXW7的表达情况。在数据库中再利用Affymetrix 2.0芯片对12例人正常卵巢上皮细胞和12例人卵巢癌上皮细胞中的表达谱情况进行了分析。抽取FBXW7在正常人卵巢上皮细胞和卵巢癌上皮细胞中的表达数值,进而进行统计学分析。(2)培养包括A2780cp、A2780s、SKOV3和CAOV3上皮性卵巢癌细胞以及正常卵巢上皮细胞HOEC。(3)收集细胞总蛋白和总m RNA,利用WB和real-time PCR检测FBXW7基因在蛋白和m RNA水平上的表达情况。结果:(1)FBXW7在12例正常人卵巢上皮细胞中的表达值为907.0±76.36;FBXW7在12例人卵巢癌上皮细胞中的表达值为599.9±54.31;FBXW7在正常人卵巢上皮细胞中的表达情况显著高于上皮性卵巢癌上皮细胞中的表达情况。(2)于蛋白水平上FBXW7在正常卵巢上皮细胞HOEC中高表达;在A2780cp、SKOV3和CAOV3细胞中无表达;在A2780s细胞中低表达。(3)于m RNA水平上,相比于卵巢上皮细胞HOEC,FBXW7在A2780cp、A2780s、SKOV3和CAOV3细胞中均处于低表达的情况。结论:FBXW7在正常人卵巢上皮细胞中的表达显著高于上皮性卵巢癌上皮细胞中的表达第二章体外细胞实验研究FBXW7对上皮性卵巢癌细胞生长的作用及机理目的:研究FBXW7对上皮性卵巢癌细胞生长作用的影响方法:(1)构建pc DNA3.1载体介导的人FBXW7过表达质粒,然后用于转染A2780cp和A2780s细胞,用WB方法检测蛋白水平的FBXW7的表达。(2)利用CCK8实验检测细胞增殖情况、利用克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。(3)PI染色结合流式分析对p-FBXW7质粒转染组和对照质粒转染组上皮性卵巢癌细胞的周期分布情况进行检测。(4)利用WB对p-FBXW7质粒转染后经嘌呤霉素筛选得到的p-FBXW7质粒稳定过表达组和对照组细胞中凋亡相关蛋白的表达情况进行检测。(5)利用WB对FBXW7过表达上皮性卵巢癌细胞和对照组细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bcl-x L、Caspase-3和周期相关蛋白Cyclin B1、Cyclin D1和Cyclin E1的表达情况进行检测,进而明确FBXW7调控上皮性卵巢癌细胞生物学特性的分子机制。结果:(1)过表达FBXW7能显著抑制A2780cp及A2780s细胞细胞的增殖,其抑制率分别为56.2%及58.7%。(2)过表达FBXW7能显著抑制A2780cp及A2780s细胞的克隆形成,对克隆形成的抑制率分别为75.6%及77.3%。(3)过表达FBXW7显著促进A2780cp细胞凋亡的发生(Ctrl组细胞的凋亡率为:3.9±0.6%;FBXW7过表达组细胞的凋亡率为13.4±0.9%);过表达FBXW7显著促进A2780s细胞凋亡的发生(Ctrl组细胞的凋亡率为:4.1±0.49%;FBXW7过表达组细胞的凋亡率为14.8±2.2%)。(4)过表达FBXW7有效将A2780cp细胞阻滞在G1期(Ctrl组细胞的G1期细胞率为:46.7±6.5%;FBXW7过表达组细胞的G1期细胞率为68.3±7.3%);2)过表达FBXW7有效将A2780s细胞阻滞在G1期(Ctrl组细胞的G1期细胞率为:52.1±3.8%;FBXW7过表达组细胞的G1期细胞率为70.1±8.2%);(5)在A2780cp和A2780s细胞中过表达FBXW7能显著诱导凋亡促进蛋白Bax和Caspase 3的表达并且能显著下调凋亡抑制蛋白Bcl-2和Bcl-x L的表达。抑制周期检查点蛋白Cyclin E1和Cyclin D1的表达,但对Cyclin B1的表达无显著的调控作用。结论:过表达FBXW7能显著抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖、克隆形成,促进凋亡的发生。同时,过表达FBXW7能有效将上皮性卵巢癌细胞阻滞在G1期,抑制细胞周期进行。对以上凋亡促进蛋白及抑制蛋白的研究结果提示在上皮性卵巢癌细胞中过表达FBXW7调控了线粒体依赖的凋亡发生途径。第三章动物实验研究FBXW7对上皮性卵巢癌皮下移植瘤生长的作用及机理研究目的:从动物实验层面上研究FBXW7对上皮性卵巢癌皮下移植瘤生长的作用及机理方法:将所筛选得到的FBXW7稳定过表达A2780cp细胞和对照组细胞接种到裸鼠右腹侧皮下,建立皮下移植瘤。(1)绘制肿瘤生长曲线,进而明确FBXW7对上皮性卵巢癌皮下移植瘤生长的调控作用。(2)石蜡包埋和切片后利用免疫组化染色检测FBXW7的表达情况,明确FBXW7在上皮性卵巢癌皮下移植瘤组织中高表达。(3)利用免疫组化染色检测增殖相关指标PCNA和肿瘤血管生成相关指标CD31的表达情况;(4)利用TUNEL检测肿瘤组织中细胞凋亡情况。结果:(1)过表达FBXW7能显著抑制A2780cp皮下移植瘤生长,对肿瘤体积的抑制率为70.6%(Ctrl组肿瘤体积为:1463.2±175.3mm3;FBXW7组肿瘤体积为:432.5±65.3mm3);对肿瘤重量的抑制率为69.5%(Ctrl组肿瘤体积为:1.38±0.21g;FBXW7组肿瘤体积为:0.42±0.08g)。(2)在p-FBXW7质粒稳定转染组的皮下移植瘤组织中FBXW7显著高表达;p-FBXW7质粒稳定转染组的皮下移植瘤组织中FBXW7的阳性率为62.3±4.8%。(3)在A2780cp的Ctrl组与FBXW7组相比,其皮下移植瘤组织中处于增殖期的细胞数分别为为70.2±8.2%及18.3±4.2%。(4)比较A2780cp的Ctrl组及p-FBXW7组皮下移植瘤组织中处于凋亡的细胞分别为5.3±1.5%及24.3±4.4%。(5)在Ctrl组A2780cp皮下移植瘤组织中血管密度为43.8±8.7;在FBXW7组A2780cp皮下移植瘤组织中血管密度为8.4±3.2。结论:过表达FBXW7抑制A2780cp皮下移植瘤生长,显著抑制肿瘤细胞的增殖活性促进细胞凋亡的发生并且能显著抑制肿瘤血管生成。